Adaptive potential of marine symbiosis to climate change: A first step in generating gnotobiotic clams

Ruditapes philippinarum is a clam species of farmed bivalves introduced in Europe during the 1970s and 1980s. It represents around 15% of the protein consumed worldwide, while Italy is responsible for about 96% of their farming in the EU. Over the last two decades, an extensive decline in wild clam populations has been observed, but the reason behind this is still an open question. This decline seems related to climate change consequences such as increased water salinity, pH decrease, food distribution variability, dysbiosis, and temperature enhancement. Climate change is responsible for increased heat waves' (HW) frequency and intensity. HWs are unusual episodes of hot weather for an extended period that can bring considerable consequences to predominantly Mediterranean marine life. Predictions show an increase in the mass mortality risk of Ruditapes philippinarum (Manila clam) from 2060. Extensive evidence has been gathered supporting the decrease in phylogenetic diversity of host microbiomes, and dysbiosis, in response to warming. The role of microbiomes in determining the thermal tolerance of hosts has emerged as a significant area of research in the past twenty years. Early studies into thermotolerance in plants found that exposure to a high but non-lethal temperature for a brief period can increase their ability to handle future, potentially lethal temperatures. Microbes can modulate different processes, such as molecular, biochemical, and cellular activities in plants, affecting the temperature stress response. For plants, this tolerance can last for many days and, in some cases, can be transferred to the next generation. This Thesis is part of a more extensive work aiming at testing the effect on microbiota-adapted communities of R. philippinarum to protect Manila clams from thermal stress, which can be a possible solution to reduce the threat of mass mortality of R. philippinarum. Studies have shown that disruptions in microbiomes due to changes in temperature profoundly affect crucial functions within the host organism and that resistance to elevated temperatures is obtained by microbiota transplant of heat-pre-conditioned organisms. To understand if microbiota variations in heat-primed R. philippinarum enable the survival of clams in high-temperature stress such as HWs, the generation of germ-free (GF) clams and the use of a controlled environment are necessary. Developing sterile clams is the first step that will precede microbiota transplant from heat-primed clams to untreated GF clams, allowing us to analyze if pre-treated clams' microbiota confers resistance to HWs. This Thesis aims at developing a protocol to successfully produce sterile adult R. philippinarum. The developed protocol involves using a mix of five antibiotics (Erythromycin, Ampicillin, Streptomycin sulfate, Ciprofloxacin, and Cefotaxime sodium). Our results show that starting from a 10^6 CFU/mL microbial load, a complete clearance of bacterial communities is achieved 24 hours after the first antibiotic treatment.

Ruditapes philippinarum è una specie di vongola della classe dei bivalvi, che attualmente rappresenta circa il 15% delle proteine consumate a livello mondiale. L’allevamento di Ruditapes philippinarum è stato introdotto in Europa negli anni '70 e '80 del secolo scorso, e attualmente l'Italia è responsabile di circa il 96% del loro allevamento nell'UE. Negli ultimi due decenni è stato osservato un importante diminuzione della popolazione di vongole selvatiche, ma le ragioni di questo fenomeno sono ancora oggetto di studio. Questa diminuzione della popolazione sembra essere legata alle conseguenze del cambiamento climatico, come l'aumento della salinità dell'acqua, la diminuzione del pH, la variabilità della distribuzione del cibo, la disbiosi e l'aumento della temperatura. Il cambiamento climatico è responsabile dell'aumento della frequenza e dell'intensità delle Heat waves (HW), le quali sono episodi insoliti di clima caldo per un lungo periodo che possono portare enormi conseguenze soprattutto alla vita marina del Mediterraneo. Infatti, le previsioni indicano un aumento del rischio di mortalità di massa di Ruditapes philippinarum (vongola di Manila) a partire dal 2060. Sono state raccolte numerose prove a sostegno della diminuzione della diversità filogenetica dei microbiomi degli ospiti in risposta a temperature elevate. Il ruolo dei microbiomi nel determinare la tolleranza termica degli ospiti è emerso come un'importante area di ricerca negli ultimi vent'anni. I primi studi sulla termotolleranza, che sono stati condotti sulle piante, hanno concluso che un precedente trattamento termico ad una alta temperatura non letale per un breve periodo di tempo produce termotolleranza a future temperature letali. In particolare, i microorganismi sono in grado di modulare diversi processi come le attività molecolari, biochimiche e cellulari nelle piante, che possono essere coinvolte nella risposta allo stress da alte temperature. Per le piante, questa tolleranza può durare molti giorni e in alcuni casi può essere trasferita alla generazione successiva. Questa Tesi fa parte di un lavoro più ampio che mira a testare l'effetto delle comunità microbiota-adattate di R. philippinarum nel proteggere le vongole non trattate dallo stress termico, che può essere una possibile soluzione per ridurre la minaccia di mortalità di massa di R. philippinarum. Alcuni studi hanno dimostrato che i cambiamenti del microbioma dovuti a variazioni di temperatura hanno effetti rilevanti sulle funzioni cruciali dell'organismo ospite e che la resistenza a temperature elevate può essere ottenuta mediante il trapianto di microbiota di organismi sottoposti a stress termico. Per capire se il cambiamento del microbiota di R. philippinarum, precondizionato, consente la sopravvivenza delle vongole in condizioni di stress da alta temperatura come le HWs, è necessario studiare le relazioni ospite-microorganismi in un ambiente controllato. Inoltre, per comprendere la complessa interazione ospite-microrganismo è essenziale utilizzare organismi Germ-free (GF). Questo è il primo passo che precederà il trapianto di microbiota da vongole sottoposte a trattamento termico a vongole non trattate, consentendo di analizzare se il microbiota delle vongole sottoposte a stress termico conferisce resistenza alle HWs. L’obiettivo di questa Tesi è lo sviluppo di un protocollo per produrre esemplari adulti di R. philippinarum Germ-free. Il protocollo sviluppato prevede l'utilizzo di una miscela di cinque antibiotici (Eritromicina, Ampicillina, Streptomicina solfato, Ciprofloxacina e Cefotaxime sodico). I risultati mostrano che a partire da una carica microbica di 10^6 CFU/mL, si ottiene una completa eliminazione delle comunità batteriche 24 ore dopo il primo trattamento antibiotico.