MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO CON BASI MOLECOLARI ATTO ALL'IDENTIFICAZIONE DEGLI ELEMENTI CIS- E TRANS-REGOLATORI IN VITE

Cis-Regulatory Elements (CREs) are genomic elements that control gene expression by long-range DNA interactions and by recruiting trans-acting factors to chromatin. The identification, in situ, of the molecular composition of a specific cis-regulatory element could provide new information on the mechanisms that regulate its activity in different conditions, also contributing to identify the most efficient intervention method to alter the expression of key genes related to important traits such as quality, productivity or resistance to biotic or abiotic stress. The limits of most of the approaches aimed at deciphering the organization and structure of a specific CRE lies in the fact that the purification of a small segment of chromatin from the nucleus remains a significant challenge. In this regard, a new protocol is being developed aimed at analyzing these regulatory sequences in the genome based on CRISPR/Cas9 technology. In this thesis, preliminary studies are presented to lay the foundations for the creation of a new biotechnological approach that will allow the analysis of cis- and trans-regulatory elements in plants. The protocols here described allowed to extract the protoplasts from the vine leaf tissue, to transfect the extracted protoplasts both with a plasmid and with a ribonucleoprotein (RNP) and finally, to fix the proteins interacting with it on the chromatin. These results, together with the CRISPR-FISH analysis performed to verify the binding specificity of a RNP on the target sequence, will contribute to the development of an innovative biotechnological approach based on the selective immunoprecipitation of DNA-protein complexes mediated by a biotinylated CRISPR-dCas9. The proteomic and genomic analyses, based on mass spectrometry (MS) and NGS sequencing, will allow the identification of regulatory proteins and long-range DNA interactions that regulate the functionality of the analyzed loci. The results obtained with this revolutionary approach could be used to breed the desired vine traits in a precise and rapid way and will allow the outline of new cultivation technologies.

Gli elementi cis-regolatori (CRE) controllano l'espressione genica attraverso le interazioni a lungo raggio del DNA ed il reclutamento dei fattori regolatori in trans (fattori di trascrizione - TF) sulla cromatina. L'identificazione, in situ, della composizione molecolare di uno specifico CRE, potrebbe fornire nuove informazioni sui meccanismi che ne regolano l’attività in varie condizioni, contribuendo, inoltre, a identificare il più efficiente metodo d’intervento per alterare l'espressione di geni chiave relativi a caratteri di interesse quali la qualità, la produttività e la resistenza a stress biotici o abiotici. Il limite, in qualsiasi approccio volto a decifrare l'organizzazione e la struttura di uno specifico CRE, risiede nel fatto che la purificazione di un piccolo segmento di cromatina dal nucleo rimane una sfida significativa. A tal proposito, il gruppo di ricerca del laboratorio di genetica e genomica del DAFNAE (UniPD) sta mettendo a punto un nuovo protocollo molecolare basato sulla tecnologia CRISPR/Cas9 volto ad analizzare queste sequenze regolatrici nel genoma. In questo elaborato di tesi vengono presentati degli studi preliminari eseguiti per porre le basi alla creazione di un nuovo approccio biotecnologico che permetterà l’analisi degli elementi cis- e trans-regolatori nelle piante. I protocolli descritti hanno permesso di estrarre i protoplasti dal tessuto fogliare di vite, trasfettare i protoplasti estratti sia con un plasmide che con una ribonucleoproteina (RNP) ed infine, di fissare sulla cromatina le proteine interagenti con essa. Questi risultati, assieme all’analisi CRISPR-FISH eseguita per verificare la specificità di legame di una RNP sulla sequenza bersaglio, permetteranno di sviluppare un innovativo approccio biotecnologico basato sulla immunoprecipitazione selettiva dei complessi DNA-proteina mediata da un CRISPR-dCas9 biotinilato. Le analisi, proteomica e genomica, basate su spettrometria di massa (MS) e sequenziamento NGS, permetteranno l'identificazione delle proteine regolatrici e le interazioni del DNA a lungo raggio che regolano le funzionalità dei loci analizzati. I risultati ottenuti con questo approccio rivoluzionario potranno essere utilizzati per allevare in modo preciso e veloce i tratti della vite desiderati e permetteranno di delineare nuove tecnologie di coltivazione.