Analisi statistiche dell'esocitosi nella linea cellulare INS-1 utilizzando differenti protocolli di depolarizzazione per aumentare la comprensione delle cellule beta umane

Pancreatic β cells found in the islets of Langerhans within the pancreas are accountable for the synthesis and secretion of insulin. The rising blood glucose levels cause insulin secretion, displayed in a biphasic pattern. Like nerve and endocrine cells, pancreatic β cells exhibit electrical excitability and generate electrical activity with a bursting pattern that includes a phase of rapid spikes followed by a quiescent phase without spikes. This process holds significance for islet-coupled pancreatic β-cells due to its capability to generate oscillations in Ca2+ concentration. In contrast, uncoupled single cells exhibit a pattern characterized by a tendency to spike. Bursting and spike aggregation enhances the calcium oscillation amplitude, potentially affecting insulin secretion. There is solid evidence that impaired insulin secretion is the primary factor predisposing individuals to pathologies, including type 2 diabetes. It is a complex and essential process to examine exocytosis and the factors underlying secretion to better comprehend the mechanisms that trigger these pathologies. In this thesis, I examine the data obtained from a study that investigated exocytosis through two methods: patch-clamp cell-capacitance measurements and live-cell imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Exocytosis was assessed through the increase in capacitance, as measured by patch-clamp methods, and the evaluation of the number of events, through TIRF microscopy, following the application of different depolarisation protocols mimicking bursting and spiking. As a further analysis, the recordings, made on the cells, were analysed using an algorithm implemented in MATLAB, which makes it possible to identify the edges of the cell and the granules within it, in order to assess through the disappearance of these the number of events that occurred. Statistical analysis revealed no significant differences between the protocols studied. The burst protocols exhibited rapid growth followed by stabilisation over time, whereas the spike protocols showed an increasing trend with low capacitance values in the first milliseconds to reach values similar to those of the burst protocols at the end. The findings differ from what is proposed in the literature for pituitary cells where bursting cells exhibit a greater amplitude of Ca2+ fluctuations. As a result, a hypothesis has been put forward suggesting that bursting releases more hormone than spiking. This difference from what is stated in the literature could be attributed to many reasons. For example, the different behaviour of the granules inside the cell may depend on their position, there may be a delay in the release of the granules after the channel is opened, or it may be due to the fact that we are analysing data from cell lines. Based on our analysis, it may be reasonable to evaluate various protocols under specific conditions. For instance, studying granule behaviour at varying distances from the channel and on mouse and human cells could reveal different behaviours than those observed on the cell line. Proper evaluation of these protocols is necessary. It is crucial to investigate the diverse effects of depolarisations to identify suitable therapeutic strategies for preventing or mitigating the disease's progression. Clear understanding is necessary to determine the most effective approach to block or improve such impacts.

Le cellule β pancreatiche, che si trovano nelle isole di Langerhans all'interno del pancreas, sono responsabili della sintesi e della secrezione insulinica. L'aumento dei livelli di glucosio nel sangue provoca la secrezione di insulina, che si manifesta con un pattern bifasico. Come le cellule nervose ed endocrine, le cellule β pancreatiche mostrano un’eccitabilità elettrica che va a generare un’attività elettrica caratterizzata da un modello di bursting che comprende una fase di picchi rapidi (spikes) seguita da una fase di quiescenza senza picchi. Questo processo è importante per le cellule β pancreatiche accoppiate alle isole, in quanto è in grado di generare oscillazioni nella concentrazione di Ca2+. Al contrario, le singole cellule non accoppiate, mostrano un modello contraddistinto dalla tendenza a generare picchi. Il bursting e gli spike aggregati aumentano l'ampiezza dell'oscillazione del calcio, influenzando potenzialmente la secrezione di insulina. È stato dimostrato che un'alterata secrezione di insulina corrisponde al fattore principale per la predisposizione degli individui a patologie, tra cui il diabete di tipo 2. L’analisi dell'esocitosi e dei fattori alla base della secrezione, sono dei processi complessi ed essenziali da esaminare, in modo da poter comprendere meglio i meccanismi che innescano queste patologie. In questa tesi, sono andata ad analizzare i dati ottenuti da uno studio che ha indagato l'esocitosi attraverso due metodi: le misure di capacitanza cellulare in patch-clamp e l’imaging di cellule vive mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). L'esocitosi è stata valutata attraverso l'aumento della capacità, misurata con metodi patch-clamp, e la valutazione del numero di eventi, attraverso la microscopia TIRF, in seguito all'applicazione di diversi protocolli di depolarizzazione che imitano il bursting e lo spiking. Come ulteriore analisi, le registrazioni, effettuate sulle cellule, sono state analizzate utilizzando un algoritmo implementato in MATLAB, che ha permesso l’identificazione dei bordi della cellula e dei granuli al suo interno, per valutare attraverso la scomparsa di questi ultimi il numero di eventi verificatisi. L'analisi statistica non ha rivelato differenze significative tra i protocolli studiati. I protocolli di burst hanno mostrato una crescita rapida seguita da una stabilizzazione nel tempo, mentre i protocolli di spike hanno mostrato una tendenza all'aumento con valori di capacità bassi nei primi millisecondi per raggiungere valori simili a quelli dei protocolli di burst alla fine. Questi risultati differiscono da quanto proposto in letteratura per le cellule ipofisarie, dove le cellule in burst mostrano una maggiore ampiezza delle fluttuazioni di Ca2+, ed è quindi stata avanzata l'ipotesi che il burst rilasci più ormone rispetto allo spiking. Questa differenza, nei nostri risultati, rispetto a quanto riportato in letteratura potrebbe essere attribuita a molte ragioni. Ad esempio, il diverso comportamento dei granuli all'interno della cellula potrebbe dipendere dalla loro posizione, potrebbe esserci un ritardo nel rilascio dei granuli dopo l'apertura del canale o potrebbe essere dovuto al fatto che stiamo analizzando dati provenienti da linee cellulari. Sulla base della nostra analisi, potrebbe essere ragionevole valutare i diversi protocolli in condizioni specifiche. Lo studio del comportamento dei granuli a distanze diverse dal canale e su cellule di topo e umane potrebbe rivelare comportamenti diversi da quelli osservati sulla linea cellulare. È fondamentale studiare i diversi effetti delle depolarizzazioni per identificare strategie terapeutiche adatte a prevenire o attenuare la progressione della malattia. Inoltre, è necessaria una chiara comprensione per determinare l'approccio più efficace per bloccare o migliorare tali impatti.