"Produzione e caratterizzazione biofisica di nanobodies che riconoscono proteine che imitano epitopi della proteina spike di SARS-CoV-2."

Emerging SARS–CoV–2 variants of concern presenting an array of mutations in the Spike’s S1 subunit are weakening the protective effects of vaccines and monoclonal antibodies, which are usually targeted to the receptor binding domain (RBD) domain. This calls for variant proof therapeutics that target more conserved and functionally important epitopes outside the S1 subdomain. Membrane fusion step during infection is driven by interaction between the highly conserved heptad repeat (HR) S2 regions HR1 and HR2, and thus pose as attractive targets for novel fusion inhibitors. HR1 and HR2 are known to become transiently exposed during the membrane fusion process and previous efforts to design peptidomimetic fusion inhibitors confirm that they can be targeted to achieve cell entry inhibition. Herein, we used a HR1 based mimetic protein (L3C) to select camelid variable domains of heavy chain only (VHH) antibodies (also known as ’nanobodies’ (NBs)) that bind to HR1 in vitro after alpaca immunization. Three of them belonging to a larger pool (NB113, NB248 and NB118) were investigated in this work. The first part centered around the expression, purification and structural characterization of the NBs. Results indicate that they can be produced with good yields and that they behave as expected folding in monomeric form and adhering to the canonical characteristics of NBs. In a second step we characterized the binding mode of the NBs to the HR1 mimetic protein by employing biophysical methods such as differential scanning and isothermal titration calorimetry. Results indicate a strong interaction with HR1 with affinities in the range of hundreds nM. According to our results only NB118 is able to compete with the HR1–HR2 binding. NB113 binding to HR1 is only partially displaced by HR2, but no clear evidence of competition was obtained. Lastly NB248 appears to form a ternary complex with HR1 and HR2, showing no signs of binding displacement. Experiments aimed to map the binding epitopes of the NBs on HR1 revealed that all bind predominantly to the C–terminal region of HR1, implying that this region could be substantially more antigenic than the N–terminal part. This work explores for the first time the possibility of using S2 targeting NBs as SARS–CoV–2 fusion inhibitors and may help provide a structural framework for the quest to find therapeutic NBs with cross- neutralizing potential.

Varianti emergenti di preoccupazione del SARS-CoV-2, che presentano una serie di mutazioni nel sottodominio S1, stanno indebolendo gli effetti protettivi dei vaccini e degli anticorpi monoclonali, che di solito mirano al dominio RBD. Cio` richiede terapie in grado di resistere alle varianti che mirano ad epitopi piu` conservati e funzionalmente importanti al di fuori del sottodominio S1. Il passaggio di fusione delle membrane durante l’infezione `e guidato dall’interazione tra le regioni altamente conservate della ripetizione eptadica HR1 e HR2, e rappresentano quindi entrambe obiettivi interessanti per nuovi inibitori di fusione. Si sa che HR1 e HR2 vengono esposte transitoriamente durante il processo di fusione delle membrane e gli sforzi precedenti per progettare inibitori di fusione peptidomimetici confermano che possono essere bersagliate per ottenere l’inibizione dell’ingresso nella cellula. In questo studio, abbiamo utilizzato una proteina mimetica basata su HR1 (L3C) per selezionare domini variabili (VHH) di anticorpi camelidi con solo la catena pesante (noti anche come ”nanobodies” (NBs) in inglese), che si legano a HR1 in vitro dopo l’immunizzazione di alpache. Tre di essi appartenenti a un gruppo piu` ampio (NB113, NB248 e NB118) sono stati analizzati in questo lavoro. La prima parte si `e concentrata sull’espressione, la purificazione e la caratterizzazione strutturale dei NBs. I risultati indicano che possono essere prodotti con buone rese e che si comportano come previsto, piegandosi nella forma monomerica e aderendo alle caratteristiche canoniche dei NBs. In un secondo passaggio, abbiamo caratterizzato la modalita` di legame dei NBs alla proteina mimetica HR1 utilizzando metodi biofisici come la calorimetria differenziale a scansione e la caloimetria isotermica di titolazione. I risultati indicano una forte interazione con HR1, con affinita` nell’ordine delle centinaia nM. Secondo i nostri risul- tati, solo NB118 `e in grado di competere con il legame HR1-HR2. Il legame di NB113 a HR1 `e solo parzialmente indebolito da HR2, ma non sono state ottenute evidenze chiare di competizione. Infine, NB248 sembra formare un complesso ternario con HR1 e HR2, senza mostrare segni di dispiazzamento del legame. Esperimenti svolti con l’obbiettivo di mappare gli epitopi di legame dei NBs su HR1 hanno rivelato che tutti si legano prevalentemente alla regione C-terminale di HR1, il che implica che detta re- gione potrebbe essere sostanzialmente piu` antigenica della parte N-terminale. Questo studio esplora per la prima volta la possibilit`a di utilizzare NBs che bersagliano S2 co- me inibitori di fusione del SARS-CoV-2 e potrebbe contribuire a fornire una struttura di base per la ricerca di NBs terapeutici con potenziale di neutralizzazione incrociata.