Transcriptome analysis to investigate different stages of pluripotency towards 3D morphogenesis

Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) offer a valuable tool to recreate in vitro models to emulate 3D morphogenesis. Derived from somatic cells through reprogramming with specific pluripotency factors, hiPSCs can exist in two stages: naïve and primed, corresponding to pre- and post-implantation pluripotent epiblast cells. Despite being chronologically close during embryogenesis, they differ in several key attributes, yet both possess the ability to differentiate into all three germ layers and give rise to specific cell types. The application of RNA sequencing (RNA-seq) technology for transcriptome analysis proves to be a robust method to assess their characteristics and the signature of these two pluripotent states. This approach detects and interprets RNA nucleotide sequences contained in samples to gain a comprehensive view on cellular activities and molecular mechanisms. It can be performed in two ways: bulk RNA-seq deals with average gene expressions of each sample and the entire set of human genes, while single-cell RNA-seq is able to identify the gene expression of each individual cell but works with a smaller gene set. This thesis aims to investigate different stages of hiPSCs and their developmental potency through transcriptomics data analysis. First, a bulk RNA-seq analysis was performed on a 20-day differentiation trajectory aimed to obtain neuroepithelial cysts starting from naïve single cells. Secondly, bulk and single-cell RNA-seq analyses were conducted on primed hiPSCs and their differentiation into the three germ layers. The bulk RNA-seq analysis of naïve hiPSCs transitioning to neuroepithelium showed a clear time trajectory, with divergence in transcriptional profiles of early time points and then convergence of late time points. Integrated PCA and heatmaps indicated a transition from naïve hiPSCs to a primed-like state culminating in neuroepithelium. Time analysis highlighted that pluripotency-related gene expression decreased over time, while neural commitment related genes increased. The evaluation of neural regionalization on day 20 showed upregulation of genes related to all three brain regions, indicating no specific regionalization. On the other hand, analyzing primed hiPSCs revealed transcriptional variability between 2D and 3D cultures, and between nascent and expanded hiPSCs. Bulk analysis confirmed higher heterogeneity in expanded hiPSCs. Nascent hiPSCs showed a higher expression of pluripotency-related genes, so they were identified as a suitable starting point for differentiation. Three differentiations from nascent hiPSCs to all germ layers confirmed the upregulation of genes related to each sample commitment. In conclusion, this work enabled us to validate both naïve and primed hiPSCs as a good starting point for in vitro 3D morphogenesis, since all the protocols correctly led to the intended differentiation. Beyond the immediate purpose of this thesis, the insights garnered from investigating naïve and primed hiPSCs hold significant promises for biomedical research and future applications in the field of stem cell biology.

Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) costituiscono un prezioso strumento per ricreare modelli in vitro al fine di replicare la morfogenesi 3D. Derivate da cellule somatiche attraverso un processo di reprogramming che usa specifici fattori di pluripotenza, le hiPSCs possono esistere in due stati: naïve e primed, che corrispondono rispettivamente alle cellule pluripotenti dell’epiblasto prima e dopo l’impianto. Nonostante la loro vicinanza cronologica durante l'embriogenesi, questi due stati differiscono per diverse caratteristiche, ma entrambi conservano la capacità di differenziarsi in tutti e tre i foglietti germinali dando origine a tipi cellulari specifici. L'applicazione della tecnologia di RNA sequencing (RNA-seq) per l'analisi del trascrittoma si dimostra un metodo robusto per valutare le caratteristiche e la signature di questi due stadi di pluripotenza. Questo approccio è in grado di rilevare e interpretare le sequenze nucleotidiche dell'RNA presenti nei campioni, offrendo così una visione completa delle attività cellulari e dei meccanismi molecolari. Può essere eseguito in due modalità: il bulk RNA-seq utilizza le espressioni geniche medie di ciascun campione e l’intero set di geni umani, mentre il single-cell RNA-seq è in grado di identificare l'espressione genica di ogni singola cellula, sebbene con un set di geni più limitato. L’obiettivo di questa tesi è investigare i due diversi stati delle hiPSCs e la loro pluripotenza attraverso l'analisi dei dati di trascrittomica. Inizialmente, è stata condotta un'analisi bulk RNA-seq su una traiettoria di differenziamento di 20 giorni, volta a ottenere cisti neuroepiteliali a partire da singole cellule naïve. Successivamente, sono state effettuate analisi bulk e single-cell sulle hiPSCs primed e sui loro differenziamenti nei tre foglietti germinali. L'analisi bulk RNA-seq delle hiPSCs naïve ha mostrato una chiara traiettoria temporale, in cui i profili trascrizionali dei primi time point sono molto distanti, mentre quelli degli ultimi time point sono più vicini. Le PCA integrate e le heatmap mostrano che la transizione parte da hiPSCs naïve, passa per uno stato simile a quello primed, e infine diventa neuroepitelio. L'analisi temporale ha evidenziato una diminuzione nel tempo dell'espressione dei geni correlati alla pluripotenza, mentre l’espressione dei geni correlati al differenziamento neurale aumenta. L’eventuale presenza di regionalizzazione è stata valutata al giorno 20 ma ha dimostrato che i geni di tutte e tre le regioni celebrali sono espressi, non mostrando quindi una regionalizzazione specifica. D'altra parte, l’analisi delle hiPSCs primed ha rivelato variabilità trascrizionale tra culture 2D e 3D e tra hiPSCs nascenti ed espanse. L'analisi bulk ha confermato una maggiore eterogeneità nelle hiPSCs espanse. Le hiPSCs nascenti esprimono di più i geni correlati alla pluripotenza rispetto alle espanse, e questo ha permesso di valutarle come un punto di partenza adatto per la differenziazione. Le tre differenziazioni dalle hiPSCs nascenti in tutti i foglietti germinali dimostrano che i geni correlati al differenziamento di ciascun campione sono correttamente espressi. In conclusione, questo studio ci ha permesso di confermare che sia le hiPSCs naïve che quelle primed costituiscono un buon punto di partenza per la morfogenesi 3D in vitro, poiché tutti i protocolli hanno portato correttamente al differenziamento desiderato. Oltre allo scopo immediato di questa tesi, le considerazioni ottenute dall'indagine sulle hiPSCs naïve e primed offrono grandi promesse per la ricerca biomedica e per future applicazioni nel campo della biologia delle cellule staminali.