Investigation of the morphological and molecular effect of the phosphatase PTEN in primary murine Schwann cells

Human PTEN (phosphatase and tensin homolog) is a dual specific phosphatase that targets either protein or lipid substrates. It is considered a tumour suppressor due to its cytoplasmic activity that counteracts the activation of the PI3K/AKT signalling pathway, fundamental for the regulation of cell survival, growth and proliferation. Recently, it was discovered that PTEN can be localized not only in the cytoplasm, but also in the nucleus. Its nuclear functions still need to be further elucidated, but they seem to be involved in cell cycle regulation, DNA double strand breaks (DSBs) repair mechanism and in the structural stability of chromosomes. The dysregulation of the PI3K/AKT pathway is quite common in Schwann cells (SCs) derived tumours and it seems to be one of the main causes of cancer progression towards malignant peripheral nerve sheath tumours (MPNSTs). SCs are of paramount importance for neuron development, metabolic support and myelination under physiological conditions, but they also have a main role in peripheral nerve injury (PNI), because they can transdifferentiate into repair SCs, leading the regeneration process. Many of these mechanisms seem to be influenced by the PI3K/AKT signalling pathway. The knowledge of PTEN activity in SCs is very limited. In this project we aimed to further characterise the implication of PTEN protein in the PI3K/AKT signalling pathway and the eventual involvement of PTEN cellular localization (cytoplasm or nucleus) in the morphology of primary murine SCs. A deeper characterisation may be useful in the development of new treatments for SC derived cancer like MPNST and in patients suffering from PNI, where the role of SCs is fundamental to drive the healing process. To investigate the role of PTEN in SCs, primary SC cultures were prepared and electroporated with plasmids expressing PTEN either in the nucleus or in the cytoplasm. The morphology of SCs was analysed by fluorescence microscopy. On the other hand, molecular analysis was performed on SCs treated with the PTEN inhibitor bpV (HOpic). The experiments show that the subcellular localization of PTEN does not influence primary murine SC morphology. In addition, inhibition of the phosphatase with bpV (HOpic) did not activate PI3K/AKT pathway at protein expression level. Nonetheless, PTEN inhibition enhanced the gene expression level of different proliferation markers and one cytokine, proving a slight involvement of PTEN in the regulation of proliferation in primary murine Schwann cells and a possible involvement in immune regulation.

Human PTEN (phosphatase and tensin homolog) è una dual specific phosphatase che ha come substrati sia proteine che lipidi. E' considerata un soppressore tumorale grazie alla sua attività citoplasmatica che contrasta l'attivazione della via del segnale PI3K/AKT, fondamentale per la regolazione della sopravvivenza cellulare, crescita cellulare e proliferazione. Recentemente è stato scoperto che PTEN può essere localizzata non solo nel citoplasma ma anche nel nucleo. Le due funzioni nucleari devono ancora essere meglio elucidate, ma sembrano essere coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare, nel meccanismo di riparazione delle rotture del doppio filamento del DNA (DSB) e nella stabilità strutturale dei cromosomi. La disregolazione della cascata del segnale di PI3K/AKT è abbastanza comune nei tumori derivanti da cellule di Schwann e sembra essere una delle principali cause di progressione di tumore verso tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNSTs). Le cellule di Schwann sono di cruciale importanza per lo sviluppo neuronale, il supporto metabolic e la mielinizzazione in condizioni fisiologiche, ma possiedono anche un ruolo chiave nel danno ai nervi periferici (PNI), perchè possono transdifferenziare in cellule di Schwann riparatrici guidando il processo di riparazione. Molti di questi meccanismi sembrano essere influenzati dalla via di segnalazione PI3K/AKT. La conoscenza dell'attività di PTEN nelle cellule di Schwann è molto limitata. In questo progetto abbiamo mirato a caratterizzare ulteriormente l'implicazione della proteina PTEN nella via di segnalazione PI3K/AKT e l'eventuale coinvolgimento della localizzazione cellulare di PTEN (citoplasma o nucleo) nella morfologia delle cellule di Schwann murine primarie. Una caratterizzazione più approfondita potrebbe essere utile nello sviluppo di nuovi trattamenti per i tumori derivati ​​dalle cellule di Schwann, come MPNST, e nei pazienti affetti da PNI, dove il ruolo delle cellule di Schwann è fondamentale per guidare il processo di guarigione. Per studiare il ruolo di PTEN nelle cellule di Schwann, colture primarie di cellule di Schwann sono state preparate ed elettroporate con plasmidi che esprimono PTEN nel nucleo o nel citoplasma. La morfologia delle cellule di Schwann è stata analizzata mediante microscopia a fluorescenza. L'analisi molecolare è stata eseguita su cellule di Schwann trattate con l'inibitore PTEN bpV (HOpic). Gli esperimenti mostrano che la localizzazione subcellulare di PTEN non influenza la morfologia delle cellule di Schwann murine. Inoltre, l'inibizione della fosfatasi con bpV (HOpic) non ha attivato la via PI3K/AKT a livello di espressione proteica. Tuttavia, l’inibizione di PTEN ha aumentato il livello di espressione genica di diversi marcatori di proliferazione e di una citochina, dimostrando un leggero coinvolgimento di PTEN nella regolazione della proliferazione nelle cellule primarie di Schwann murine e un possibile coinvolgimento nella regolazione immunitaria.