Performance of DNA synthesis-dependent repair in primary fibroblasts derived from Friedreich Ataxia patients

Friedreich ataxia (FRDA) is an autosomal recessive disease and the most common inherited ataxia with an average age of onset during adolescence. FRDA causes progressive ataxia of limbs and gait, dysarthria, cardiomyopathy and an increased rate of diabetes mellitus. The most common cause of death is cardiac insufficiency due hearth hypertrophy. The disease is caused by an abnormal expansion of the GAA triplet in the first intron of FXN gene, located on chromosome 9. This mutation leads to a reduced expression of the relative protein encoded, called Frataxin. Its low expression is considered to be given by a combination of factors: there is an epigenetic silencing, with formation of heterochromatin and there is also the stall of RNA polymerase II caused by the formation of abnormal DNA-RNA hybrids, which blocks the activity of the enzyme and so the transcription of FXN mRNA. Frataxin is a mitochondrial protein which function has not been yet fully clarified. The most diffused hypothesis involves a role in cellular iron management and its lack could lead to an increase in reactive oxygen species (ROS) and a reduced availability of iron. This last condition, given the role of iron as enzyme cofactor, could be responsible for an altered activity of the enzymes which exploits it, including ribonuclease reductase (RNR). RNR is the enzyme responsible for the conversion of ribonucleoside diphosphates to deoxyribonucleoside diphosphates, a process of paramount importance in the nucleotide biosynthesis pathway. If the RNR activity is reduced, the availability of free deoxyribonucleoside triphosphates is reduced too and so both the replication and the repair of DNA are compromised. Previous experiments done in the same laboratory where this thesis was developed, demonstrated a replication stress caused by the expanded GAA repeat in lymphoblastoid cells, and diminished deoxyribonucleoside triphosphate pools in primary fibroblasts, derived from FRDA patients. The aim of this study is to investigate if the above conditions impact on DNA repair. By exposing human primary fibroblasts (in quiescent state) derived from patients and healthy donors to UV rays, the time course of the Nucleotide Excision Repair will be compared following repair synthesis labelled by 5-bromo-2’-deoxyuridine. This is the first step required to determine the informative experimental conditions and to progress forward with high throughput analysis of multiple cell lines.

L’atassia di Friedreich (FRDA) è una malattia autosomica recessiva ed è la più comune atassia ereditaria, manifestandosi per la maggior parte dei casi durante l’adolescenza. La FRDA causa una progressiva atassia degli arti, disartria, cardiomiopatia e un rischio maggiore di contrarre il diabete mellito. La più comune causa di morte è insufficienza cardiaca data da ipertrofia cardiaca. La malattia è causata da un’anomala espansione della tripletta GAA nel primo introne del gene FXN, localizzato sul cromosoma 9. Questa mutazione comporta la ridotta espressione della relativa proteina codificata, chiamata Fratassina. Si pensa che i ridotti livelli di espressione siano dovuti ad una combinazione di fattori: in aggiunta al silenziamento epigenetico, con relativa formazione di eterocromatina, si verifica il blocco della RNA polimerasi II dovuto all’anomala formazione di ibridi DNA-RNA, i quali vanno ad alterare l’attività dell’enzima e quindi la trascrizione dell’mRNA di FXN. La fratassina è una proteina mitocondriale la cui funzione non è ancora stata completamente chiarita. L’ipotesi più diffusa riguarda un suo possibile ruolo nella gestione del ferro intracellulare e la sua mancanza si rifletterebbe nell’aumento di ROS ed una ridotta disponibilità di ferro. Quest’ultima condizione, considerata la natura del ferro come cofattore enzimatico, potrebbe essere responsabile dell’alterata attività degli enzimi che lo utilizzano, tra i quali troviamo la Ribonucleotide Reduttasi (RNR). RNR è l’enzima responsabile della riduzione dei ribonucleosidi difosfato a deossiribonucleosidi difosfato, uno step fondamentale nel processo di biosintesi dei precursori del DNA. Se l’attività della RNR venisse ridotta, anche la disponibilità di deossiribonucleosidi trifosfato liberi risulterebbe ridotta e di conseguenza sia la replicazione che la replicazione del DNA verrebbero compromesse. Precedenti esperimenti, compiuti nello stesso laboratorio in cui questo si è svolta questa tesi, hanno dimostrato la presenza di stress replicativo dovuto all’espansione della ripetizione GAA in cellule linfoblastoidi, e una riduzione dei pool di deossiribonucleosidi trifosfato in fibroblasti primari, derivati da individui affetti da FRDA. Scopo della tesi è indagare se le condizioni precedentemente descritte abbiano ripercussioni sul sistema di riparazione del DNA. Dopo l’esposizione ai raggi UV di fibroblasti primari umani (in quiescenza) derivate da paziente e da donatore sano verrà confrontato l’andamento del “Nucleotide Excision Repair” seguendo l’incorporazione della 5-bromo-2’-deossiuridina durante la sintesi riparativa del DNA. Questo è il primo passo per determinare le condizioni sperimentali per poter analizzare diverse linee cellulari in contemporanea con metodiche “High Throughput”.