Dissecting the role of heme oxygenase-1 in the immunosuppressive activity of macrophages

Tumour-associated macrophages (TAMs) represent the main type of immune cells infiltrating the microenvironment of several types of tumours, where they play a key role in fostering an immunosuppressive environment which sustains tumour growth and confers resistance to various therapeutic interventions. Recent studies from our research group in glioblastoma (GBM) have disclosed a notable tumour infiltration by bone marrow-derived macrophages (BMDMs) characterized by robust immune suppressive abilities and a sustained commitment to an iron-recycling phenotype. Further studies were carried out to assess the significance of iron metabolism in the immune suppressive functions of such myeloid cells, revealing a pivotal role for heme oxygenase-1 (HO-1), the rate-limiting enzyme in the oxidative catabolism of heme, in orchestrating this immune suppressive program. Based on the observation of its enzymatic activity in microsomal fractions, HO-1 has been widely recognized as a protein associated with the Endoplasmic Reticulum (ER). However, recent studies showed that HO-1 is present also in other subcellular localisations. In particular, the 32-kDa HO-1 protein can be cleaved from the ER membrane and migrate to the nucleus as a 28-kDa truncated form, where it plays non-canonical functions. In this regard, hypoxia appears to be a major stimulus for HO-1 translocation to the nucleus, which is also known to play a remarkable role in macrophage accumulation and reprogramming in the tumour microenvironment. Based on these results by us and others, my thesis project aims to demonstrate the correlation between HO-1 subcellular localisation and the immune suppressive activity of macrophages. Using an in vitro model of immunosuppressive macrophages, we evaluated the localization of the truncated and full-length forms of HO-1 by multispectral imaging flow cytometry and Western Blot analysis. We also investigated by flow cytometry if the exposure of macrophages to hypoxia is sufficient to induce a reprogramming of their phenotype and functional activity on activated T cells. Furthermore, in order to comprehend if the nuclear HO-1 can regulate macrophage gene expression, we analysed macrophage transcriptomic profile by RNA sequencing and evaluated the modifications induced by the treatment with zinc protoporphyrin IX (ZnPPIX), an inhibitor of HO-1 previously found to be effective in restoring T cell proliferation in in vitro assays.

I macrofagi associati ai tumori (TAM) rappresentano il principale tipo di cellule immunitarie che infiltrano il microambiente di diversi tipi di tumori, dove svolgono un ruolo chiave nel favorire un ambiente immunitario soppressivo che sostiene la crescita del tumore e conferisce resistenza a varie terapie. Studi recenti condotti dal nostro gruppo di ricerca sul glioblastoma (GBM) hanno rivelato una notevole infiltrazione del tumore da parte di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) caratterizzati da considerevoli capacità di soppressione immunitaria e un fenotipo associato al riciclo del ferro. Ulteriori studi sono stati condotti per valutare l’importanza del metabolismo del ferro nelle funzioni di immunosoppressione di tali cellule mieloidi, rivelando un ruolo fondamentale per eme ossigenasi-1 (HO-1), l’enzima coinvolto nell’ossidazione catalitica dell’eme, nella messa in atto di tale programma. In base all’osservazione della sua attività enzimatica nelle frazioni microsomiali, HO-1 è stata ampiamente riconosciuta come una proteina associata al reticolo endoplasmatico (RE). Tuttavia, studi recenti hanno mostrato che HO-1 è presente anche in altre localizzazioni subcellulari. In particolare, la forma da 32 kDa di questo enzima può essere tagliata dalla membrana del RE e migrare nel nucleo come forma troncata da 28 kDa, dove svolge funzioni non canoniche. A questo proposito, uno degli stimoli principali per la traslocazione di HO-1 nel nucleo sembra essere l’ipossia, nota per svolgere un ruolo importante nell’accumulo e nella riprogrammazione dei macrofagi nel microambiente tumorale. Sulla base di questi risultati ottenuti da noi e dagli altri, il mio progetto di tesi mira a dimostrare la correlazione tra la localizzazione subcellulare di HO-1 e l’attività immunosoppressiva dei macrofagi. Utilizzando un modello in vitro di macrofagi immunosoppressivi, abbiamo valutato la localizzazione delle forme troncate e a lunghezza intera di HO-1 mediante citofluorimetria multispettrale per immagini e Western Blot. Abbiamo anche indagato mediante citofluorimetria se l’esposizione dei macrofagi all’ipossia fosse sufficiente a indurre una riprogrammazione del loro fenotipo e dell’attività funzionale sulle cellule T attivate. Inoltre, al fine di comprendere se la forma nucleare di HO-1 possa regolare l’espressione genica dei macrofagi, abbiamo analizzato il loro profilo trascrizionale mediante RNA-seq e valutato le modifiche indotte dal trattamento con zinco protoporfirina IX (ZnPPIX), un inibitore di HO-1 precedentemente risultato efficace nel ripristinare la proliferazione delle cellule T in saggi in vitro.