Produzione di bio-indigo in Synechocystis sp. PCC 6803 mediante biocatalisi whole-cell.

Cyanobacteria constitute a phylum of bacteria relevant in biotechnology due to their ability to grow through autotrophy, heterotrophy, and mixotrophy, as well as their natural competence in integrating exogenous DNA, and, above all, their relative efficiency in homologous recombination. Synthetic biology and metabolic engineering are increasingly focusing on these microorganisms for industrial aims. For this reason, in recent years their use as cell factories has emerged as a sustainable and, above all, eco-compatible resource for the production of a wide range of products, some of which have already been tested in various applications. One possible application, examined in this thesis, is the production of the dye indigo using a transgenic strain of Synechocystis sp. PCC 6803 expressing the enzyme Baeyer-Villiger monooxygenase from Methylophaga aminisulfidivorans (FMO, flavin-containing monooxygenase). Specifically, various parameters were tested to optimize the growth of this transgenic strain and maximize the yield of indigo, using indole as the starting substrate. Subsequently, the toxicity of the substrate and product for the transgenic strain was verified. In this way, it was possible to identify the initial concentration of indole and the growth phase that were conducive to optimal indigo yields. Therefore, the effective production of indigo through whole-cell biocatalysis was confirmed, and the process yield was evaluated; furthermore, a possible scale-up was examined by conducting a preliminary test in a 0.5 L photobioreactor. Further studies will be necessary to refine the scalability of the process and further engineer the metabolic pathway with the aim of improving and making the process more sustainable.

I cianobatteri sono un phylum di batteri rilevanti a livello biotecnologico per la loro abilità di crescere in autotrofia, eterotrofia e mixotrofia, per la naturale competenza a integrare DNA esogeno e, soprattutto, per la relativa efficienza di ricombinazione omologa. La biologia sintetica e l’ingegneria metabolica si stanno interessando sempre di più a questi microrganismi per scopi industriali. È in tale ottica che negli ultimi anni il loro uso come ospiti per la biocatalisi è emersa come risorsa sostenibile e, soprattutto, eco-compatibile per la produzione di un’ampia gamma di prodotti, alcuni dei quali già sperimentati in diverse applicazioni. Un possibile impiego, esaminato in questa tesi, è la produzione del colorante indaco sfruttando un ceppo transgenico di Synechocystis sp. PCC 6803 esprimente l’enzima Baeyer-Villiger monoossigenasi da Methylophaga aminisulfidivorans (FMO, flavin-containing monooxygenase). Nello specifico, sono stati testati vari parametri utili per ottimizzare la crescita di tale ceppo transgenico e massimizzare la resa di indaco, ottenibile avvalendosi di indolo come substrato di partenza. Successivamente, è stata verificata la tossicità del substrato e del prodotto per il ceppo transgenico. In questo modo, è stato possibile individuare la concentrazione iniziale di indolo e la fase di crescita utili per avere rese ottimali di indaco. Pertanto, è stata verificata l’effettiva produzione di indaco tramite biocatalisi a cellule intere (whole-cell) ed è stata valutata la resa del processo; inoltre, è stato preso in esame un possibile scale-up, realizzando una prova preliminare in un fotobioreattore della capacità di 0,5 L. Saranno necessari studi successivi atti a perfezionare la scalabilità del processo e a ingegnerizzare ulteriormente il pathway metabolico con il fine di migliorare e rendere più sostenibile il processo.