Ingegnerizzazione e ottimizzazione del dominio variabile di anticorpi a catena pesante di camelidi (VHH) per inibire il taglio autoproteolitico di LexA e l’attivazione dell’SOS Response in E. coli

Antibiotic resistance is a phenomenon born from the overuse, in the latest decades, of antibiotics, thus causing the selection of resistant bacteria strains that can only be treated with progressively more expensive and less efficient therapies and antibiotics. This creates a heavy burden on Healthcare and patients’ quality of life. To avoid the effects of antibiotics, bacteria can activate a mechanism called SOS Response. The key element of this process is the interaction between the transcriptional repressor LexA and the recombinase RecA, which can recognize one of the effects of antibiotics: DNA damage (in the form of ssDNA). As a consequence of this interaction, the LexA dimer dissociates from the DNA, so that the genes under its control, the SOS genes, can be expressed. Among those genes, there are numerous factors that can induce mutagenesis: under the selective pressure of antibiotics, this can lead to the selection of resistant strains. An approach that can be followed to fight antibiotic resistance is to inhibit the SOS Response. Nanobodies (antibody fragments corresponding to the variable region of camelid heavy chain antibodies) are one of the tools that can be used for this purpose. Previously, nanobodies against E. coli LexA have been characterized, which could inhibit the autoproteolytic cleavage of the repressor. Thanks to an artificial intelligence-based software, a number of mutations on two of these nanobodies (NbSOS1 and NbSOS3) have been identified. In this work of thesis, the aforementioned mutations were introduced by site-directed mutagenesis and mutant nanobodies were expressed on a small scale in E. coli and purified by affinity chromatography. What followed was the biochemical characterization by Fluorescence Polarization-based LexA autoproteolysis assays, which allowed to identify the more promising mutations. These mutants can be the subject of additional studies, and can be used to instruct the software for further optimizations.

L’antibiotico resistenza è un fenomeno scaturito dall’abuso, negli ultimi decenni, degli antibiotici. Il loro utilizzo incessante ha portato alla selezione di ceppi batterici resistenti, che possono essere trattati solo con farmaci e terapie progressivamente più onerose e meno efficaci. Ciò comporta un peso non indifferente sul Sistema Sanitario e sulla qualità della vita dei pazienti. L’SOS Response è uno dei meccanismi che i batteri attuano per eludere l’azione degli antibiotici; protagonista di questo processo è l’interazione tra il repressore trascrizionale LexA e la ricombinasi RecA, che riconosce una delle conseguenze dell’azione degli antibiotici, il danno al DNA (ovvero ssDNA). Da quest’interazione consegue la dissociazione di LexA dal DNA, per cui i geni sotto il suo controllo, i geni SOS, possono essere espressi. Tra questi geni vi sono numerosi fattori che incentivano la mutagenesi: sotto la pressione selettiva degli antibiotici questo risulta nella selezione di ceppi resistenti. Un approccio per combattere l’antibiotico resistenza consiste nel cercare di reprimere l’SOS Response. Tra gli strumenti utilizzabili si trovano i nanoanticorpi, frammenti anticorpali corrispondenti alla porzione variabile degli anticorpi a singola catena dei camelidi. Sono stati precedentemente caratterizzati dei nanoanticorpi contro LexA di E. coli, in grado di inibirne il taglio autoproteolitico. Tramite software basati su intelligenza artificiale sono state identificate delle mutazioni che potenzialmente possono aumentare l’attività, nello specifico, di due di questi nanoanticorpi (NbSOS1 e NbSOS3). Nel presente lavoro di tesi, le suddette mutazioni sono state introdotte mediante mutagenesi sito-specifica e i nanoanticorpi mutanti sono stati espressi su piccola scala in E. coli e purificati con cromatografia ad affinità. Sono stati quindi caratterizzati dal punto di vista biochimico tramite un saggio di autoproteolisi di LexA basato sulla Polarizzazione di Fluorescenza. Sono state così identificate le mutazioni più vantaggiose. I mutanti ottenuti possono essere oggetto di ulteriori studi e le informazioni ricavate dalla prima caratterizzazione saranno utilizzabili per ulteriori ottimizzazioni.