Listeria monocytogenes nell’industria alimentare: studio della persistenza di colture batteriche a lungo termine in condizioni di stress

Listeria monocytogenes is a ubiquitous pathogenic bacterium responsible for listeriosis, a food-borne infection that, although rare, can manifest itself with severe clinical pictures and high mortality rates, especially among fragile subjects, such as children, elderly people, pregnant women and others with weakened immune system. This microorganism can grow in the presence of wide temperature and pH ranges, adapting to the most varied stress conditions, including those found along the food chain. The survival of L. monocytogenes in hostile environments may depend not only on the activation of specific adaptation mechanisms in response to stress, but also on the pathogen’s ability to form biofilms and/or to enter a dormancy state, stopping or otherwise significantly slowing its growth. The bacterium can adopt a transient phenotype tolerant to various treatments or stresses, called persister, or it can enter a deeper dormancy state, the so-called Viable But Non-Culturable (VBNC) state, losing the ability to grow on commonly used laboratory culture media. In the context of the food industry, these phenomena may contribute to the persistence of the pathogen, for example, on surfaces or equipment in contact with food, making its eradication more difficult and its transfer to products more likely. In order to ensure the application of appropriate control measures along the food chain and thus protect the consumer health, it is essential to understand in depth the strategies implemented by L. monocytogenes to remain viable in this kind of environment and identify the circumstances and factors that can favor one response rather than another. In this thesis paper, the ability of three distinct strains of L. monocytogenes to persist under stressful conditions through the monitoring of long-term cultures has been examined. In particular, the bacteria were inoculated in a minimum medium composed mainly of salts, simulating a nutrient-poor environment, and incubated at two different temperatures, 30°C and 4°C, for an extended period of time. The performance of bacterial cells in culture has been evaluated periodically by plate count, real-time PCR combined with the use of the PMAxx dye, antibiotic (gentamicin) exposure test, biofilm test and motility test. The results obtained confirmed that L. monocytogenes can remain viable for long periods of time under limiting conditions, although its growth characteristics, including transition to a dormant form, may vary according to strain and incubation temperature.

Listeria monocytogenes è un batterio patogeno ubiquitario, responsabile della listeriosi, un’infezione di origine alimentare che, seppur rara, può manifestarsi con quadri clinici severi e tassi di mortalità elevati, in modo particolare tra i soggetti fragili, come bambini, anziani, donne in gravidanza e altri soggetti aventi un sistema immunitario compromesso. Questo microrganismo riesce a crescere in presenza di ampi range di temperatura e di pH, adattandosi alle condizioni di stress più varie, comprese quelle riscontrabili lungo la catena di produzione alimentare. La sopravvivenza di L. monocytogenes negli ambienti ostili può dipendere non solo dall’attivazione di meccanismi di adattamento specifici in risposta agli stress, ma anche dalla capacità del patogeno di formare biofilm e/o di entrare in uno stato di dormienza, arrestando o comunque rallentando significativamente la sua crescita. Il batterio può adottare un fenotipo transitoriamente tollerante a trattamenti o a stress di vario genere, denominato persister, oppure può entrare in uno stato di dormienza più profondo, lo stato vitale ma non coltivabile (Viable But Non-Culturable, o VBNC), perdendo la capacità di crescere sui terreni colturali comunemente usati in laboratorio. Nel contesto dell’industria alimentare, questi fenomeni possono contribuire alla persistenza del patogeno, ad esempio, sulle superfici o sulle attrezzature a contatto con gli alimenti, rendendo più difficile la sua eradicazione e più probabile il suo trasferimento ai prodotti. Per garantire l’applicazione di misure di controllo adeguate lungo la filiera alimentare e tutelare così la salute dei consumatori, risulta fondamentale comprendere in modo approfondito le strategie attuate da L. monocytogenes per rimanere vitale in questa tipologia di ambienti e identificare le circostanze e i fattori che possono favorire una risposta piuttosto che un’altra. In questo lavoro di tesi è stata esaminata la capacità di tre ceppi distinti di L. monocytogenes di persistere in condizioni di stress, attraverso il monitoraggio di long-term cultures. In particolare, i batteri sono stati inoculati in un terreno minimo a composizione principalmente salina, che simula un ambiente povero di nutrienti, e sono stati incubati a due diverse temperature, 30°C e 4°C, per un periodo di tempo prolungato. L’andamento delle cellule batteriche in coltura è stato valutato periodicamente mediante conta su piastra, Real-time PCR combinata con l’uso del colorante PMAxx, test di esposizione ad un antibiotico (gentamicina), test del biofilm e saggio della motilità. I risultati ottenuti hanno confermato che L. monocytogenes può rimanere vitale per lunghi periodi di tempo in condizioni limitanti, sebbene le sue caratteristiche di crescita, inclusa la transizione ad una forma dormiente, possano variare in base al ceppo e alla temperatura di incubazione.