Development of an affinity-based capture resin for microbial DSP

The production of recombinant proteins in eukaryotic and prokaryotic expression systems brought many advantages such as the faster and cheaper production of large amounts of bioproducts and the wider number of big molecules that can be produced compared to the former methodologies, which is reflected in the broader spectrum of diseases that can nowadays be treated. One of the challenges working with protein expression systems is the downstream process, which is costly and complex, in some cases composed of many isolation and purification steps, which decreases the overall yield of the process. In addition to that, apart from many monoclonal antibodies, for which a protein A based purification platform is present, there is no standard purification procedures, so it is necessary to develop a specific process for each protein, increasing the work and time required to start the production process and therefore rising the expenses. One of the solutions to this problem is to add an affinity tag to the protein of interest in order to recollect the protein through affinity chromatography, which is an efficient and specific way to isolate the targeted protein using mild conditions. Unfortunately, this approach is not always possible, and the tag may not be wanted once the drug reaches the patient. The aim of this project is to exploit a domain that is present in an increasing number of pharmaceuticals (to increase their in vivo half-life), to develop an affinity resin that can specifically purify these products out of a complex media, thus, reducing development efforts and costs and providing a way towards a platform approach. During the project, the affinity ligand was immobilized to a resin matrix, and this was used to purify two proteins containing the binding moiety. The resin was successfully proven to work, regardless of the protein expression system (the two proteins tested were produced respectively in E. coli and P. pastoris) and on the moiety site of binding (the two domains have different origin and therefore different binding site on the affinity ligand). The step yield obtained was high but not may not be sufficient to make the resin suitable for a commercial process, therefore further investigation is necessary to either find a better elution buffer or to modulate the affinity interaction allowing a higher elution efficiency.

La possibilità di produrre proteine ricombinanti nei sistemi di espressione eucariotica e procariotica ha portato molti vantaggi, tra cui la produzione più rapida ed economica di grandi quantità di bioprodotti. Inoltre, si può produrre un maggior numero di grandi molecole rispetto a quanto ottenuto con metodologie precedenti e ciò si riflette in un più ampio spettro di malattie che possono essere trattate al giorno d’oggi. Una delle difficoltà che si incontra lavorando con i sistemi di espressione proteica risiede nel downstream process poiché costoso, complesso ed in alcuni casi composto da molte fasi di isolamento e purificazione proteica che riducono la resa complessiva del processo. Inoltre, esclusa la maggior parte degli anticorpi monoclonali per i quali esiste una piattaforma di purificazione basata sulla proteina A, non sono presenti procedure di purificazione standard. È necessario quindi sviluppare un processo specifico per ciascuna proteina, aumentando il lavoro ed il tempo necessario per avviare il processo produttivo aumentandone le spese complessive. Una delle soluzioni a questo problema è di aggiungere un tag di affinità alla proteina di interesse per poi isolare la stessa attraverso la cromatografia di affinità. Questo è un modo efficiente e specifico poco impattante sulla proteina d’interesse. Sfortunatamente, questo approccio non è sempre possibile e la presenza del tag potrebbe non essere desiderata nel momento in cui il farmaco raggiunge il paziente. Lo scopo di questo progetto è quello di utilizzare un dominio presente in un numero crescente di farmaci (per aumentare la loro emivita in vivo) per sviluppare una resina di affinità in grado di purificare specificamente questi prodotti da una soluzione ad alta complessità riducendo così gli sforzi, i costi di sviluppo e fornendo una strada verso un approccio più ampio. Durante il progetto il ligando di affinità è stato immobilizzato su una resina utilizzata poi per purificare due proteine contenenti la regione di legame. La resina ha dimostrato di funzionare con successo indipendentemente dal sistema di espressione proteica (le due proteine testate sono state prodotte rispettivamente in E. coli e P. pastoris) e dalla posizione del sito di legame sul ligando di affinità (i due domini hanno origine diversa e quindi diverso sito di legame). La resa ottenuta è elevata ma potrebbe non essere sufficiente a rendere la resina adatta ad un processo commerciale. Si rende pertanto necessaria ulteriore ricerca al fine di trovare un buffer di eluizione migliore e/o per modulare l'interazione tra le due molecole affinché si possa ottenere una maggiore efficienza di eluizione.