Characterization and comparison of two oncolytic poxvirus variants

The use of modified viruses to develop oncolytic vectors and cancer vaccines represents a promising and powerful approach to the oncological treatment. In the broad landscapes of possible viral candidates, ORFv (Parapoxvirus Ovis), a dsDNA virus belonging to the Parapoxvirus family, presents several advantages that make it interesting as development platform. ORFv is indeed particularly stable and thanks to its large genome provides plenty of option for incorporation of therapeutic cargos. Moreover, it has proven to be safe in different animal models and has limited pathogenicity in human, it is able to induce a strong immune response (necessary to mount an effective antitumor response) and is able to re-infect the host (making therefore multiple-dose treatments more effective). We aimed to characterize and compare two differently-passaged ORFv variants in a panel of human tumor cell lines in vitro. To better understand ORFv replicative behavior, we performed single-step and multi-step replication kinetics assays. To assess the oncolytic potential we performed killing assay experiments using real-time imaging to monitor morphology and the expression of different cell death markers. To assess the induction of immunogenic cell death by ORFv in these tumor cells we performed western blot analysis of different cell death pathways’ activation. Both variants appear to successfully infect and replicate in the tested cell lines, even though with different yields, with the replication ability being largely dependent on the different virus cytotoxicity. Moreover, both viruses appear to induce immunogenic cell death in most cell lines, with clear indications of activation of the pyroptotic pathway. These findings suggest that the two variants may have different therapeutic applications, based on their behavior in the tested cell lines and confirm the high potential of ORFv as oncolytic and cancer vaccine vector. Further characterization of ORFv in vitro (expansion of the cell line panel, transcriptome analysis, cytokine expression, immunogenic cell death characterization) and in vivo (biodistribution, lytic capacity, toxicity, cargo expression) are needed to confirm and expand the results, and to bring ORFv to the pre-clinical phase.

L’utilizzo di virus ingegnerizzati come base per lo sviluppo di vettori oncolitici e vaccini antitumorali rappresenta un approccio promettente al trattamento oncologico. Tra i possibili candidati virali, ORFv (Parapoxvirus ovis), un virus a DNA appartenente alla famiglia dei Parapoxvirus, presenta diversi vantaggi che lo rendono un’interessante piattaforma di sviluppo. ORFv risulta infatti particolarmente stabile e, grazie al suo esteso genoma, offre numerose opzioni per l’incorporazione di geni terapeutici. Inoltre, ha dimostrato di essere sicuro in differenti modelli animali e ha una patogenicità limitata nell’uomo, è in grado di indurre una forte risposta immunitaria (necessaria per attivare un’azione antitumorale efficace) ed è in grado di re-infettare l’ospite (rendendo più efficace un trattamento a più dosi). Abbiamo cercato di caratterizzare e confrontare due varianti di ORFv con differente numero di passaggi in un pannello di cellule tumorali umane in vitro. Al fine di comprendere meglio il comportamento replicativo di ORFv abbiamo eseguito dei test di cinetica replicativa single-step e multi-step. Per valutarne il potenziale oncolitico abbiamo monitorato l’eliminazione delle cellule tumorali utilizzando tecniche di real-time imaging monitorando la morfologia cellulare e l’espressione di diversi marker di morte cellulare. Infine, per valutare l’immunogenicità della morte cellulare indotta da ORFv in queste cellule tumorali, abbiamo eseguito un’analisi Western Blot dell’attivazione di diversi pathway di morte cellulare. Entrambi le varianti sembrano infettare e replicarsi con successo nelle linee cellulari testate, anche se con rese diverse. La capacità replicativa sembra dipendere in larga misura dalla citotossicità delle due varianti. Inoltre, entrambi i virus sembrano indurre morte cellulare immunogenica nella maggior parte delle linee cellulari, con evidenze di attivazione della via piroptotica. Sulla base dei risultati ottenuti nelle diverse linee cellulari, le due varianti sembrano essere idonee per diverse applicazioni terapeutiche. Questi risultati confermano l’alto potenziale di ORFv come vettore oncolitico e vaccino antitumorale. Ulteriore caratterizzazione di ORFv in vitro (espansione del pannello di linee cellulari, analisi trascrittomica, analisi dell’espressione di citochine, ulteriore caratterizzazione della morte cellulare immunogenica) e in vivo (biodistribuzione del virus, capacità litica, tossicità, espressione di eventuali transgeni) è necessaria per confermare ed espandere i risultati e permettere l’ingresso di questo virus in una fase di sviluppo pre-clinico.