Emilina-1: studio della sua funzione in linee mutanti di zebrafish e in cellule staminali pluripotenti indotte

Emilina-1 è una proteina della matrice extracellulare appartenente alla famiglia delle EMILINE/Multimerine, la quale è abbondante in tessuti particolarmente elastici quali il cuore e i vasi sanguigni; infatti, essa svolge un ruolo fondamentale nell’apparato cardiovascolare ed è implicata in ulteriori processi cellulari quali l’elastogenesi, l’adesione cellulare, il mantenimento della morfologia delle cellule vascolari del sangue e nell’omeostasi della pressione sanguigna. Il progetto di tirocinio ha l’obiettivo di caratterizzare gli individui knock out per emilina-1a e emilina-1b di linee mutanti di zebrafish generate mediante la tecnologia del CRISPR-Cas9 per poter studiare il loro ruolo nel sistema cardiovascolare. Sono state eseguite dapprima tecniche come RT-qPCR e Western Blot per poter confermare l’assenza di emilina-1; successivamente è stata osservata una riduzione della sopravvivenza nei pesci emilina1a/emilina1b e, inoltre, studiando la loro attività locomotoria mediante DanioVision, è stata dimostrata una riduzione della distanza percorsa nei knock out rispetto i wild type. Sono state utilizzate linee transgeniche fluorescenti che hanno permesso di dimostrare una diminuzione del diametro dell’aorta dorsale e del numero dei vasi linfatici nei mutanti per emilina-1. Infine, è stata effettuata l’analisi istologica di individui di Danio rerio knock out per emilina-1a ed emilina-1b, a 15 dpf e 30 dpf, per osservare eventuali differenze a livello microscopico. In parallelo allo studio in zebrafish, è stata eseguita la generazione di cloni mediante la tecnologia del CRISPR/Cas9, la loro individuazione tramite gel elettroforesi e infine il sequenziamento delle cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) per Emilina1; dal sequenziamento è emerso un clone che presenta una mutazione in omozigosi con una delezione che altera il frame di lettura. La caratterizzazione dei mutanti knock out per i due parologhi di emilina-1 è utile al fine di comprendere il suo possibile ruolo nella rigenerazione cardiaca e nel sistema cardiovascolare.