Progettazione di un sistema di espressione basato su Escherichia Coli per la produzione di glicoproteine.

Currently the major production systems of glycosylated proteins for therapeutic use are based on the use of insect or mammalian cells as they are naturally capable of implementing the co/post-translational modifications necessary to guarantee the biological functionality of the biomolecule. However, these production systems are very expensive due to the high construction and management costs of the industrial bioreactors necessary for this purpose. Recently, studies are focusing on the use of Escherica Coli strains to produce complex proteins, as this organism has a very in-depth knowledge of both its genome and its fermentation processes, furthermore it is possible to obtain extremely efficient and economical ones that offer high yields on a large scale, allowing a purified product to be obtained in a short time. However, the lack of post-translational modifications such as glycosylation in this organism leads to its limited use in this field. The creation of an E. Coli expression system for the production of human glycoproteins could potentially lead to increased yields and a reduction in production costs and times. The aim of this thesis work was to try to build a system based on E.coli that is able to carry out O-glycosylation. This type of glycosylation consists in the transfer of sugar moieties to a serine or threonine residue. As a model protein we focused on mucins, these are high molecular weight glycoproteins secreted onto the cell surface or mucosal epithelium in animals and humans and provide a protective shield against toxins and pathogens. The O-glycosylation of mucins occurs via the transfer of GalNAc, by UDP- N -acetylgalactosaminyltransferases (GalNAc-Ts), which form the GalNAcα1 - O -serine/threonine link. An E.coli strain competently designed to have a more oxidizing cytoplasmic environment (Shuffe E.coli) also containing proteins suitable for the formation of disulfide bonds was used as the cell line. This strain was further modified to allow the soluble expression of N -acetylgalactosaminyltransferase 2 (GalNAc-T2) and the UDP-GlcNAc 4-epimerase WbgU. The latter to allow the conversion of uridine 5′-diphospho- N -acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) into uridine 5′-diphospho- N -acetylgalactosamine (UDP-GalNAc) in the bacterial cytoplasm so as to ensure the presence of the substrate sugar in the E. coli strain. To evaluate the in vivo activity of both the GalNAc-T2 glycosyltransferase and the WbgU 4-epimerase in E. coli, the Mucin 1 polypeptide was chosen as the target. The sequences of all three cloned genes were modified to eliminate any superfluous restrictions and optimized based on the frequency of the corresponding E.Coli codons. Furthermore, for all three genes a tag-SUMO sequence was fused to the N-terminus to increase their solubility. Individual proteins were expressed and purified under native conditions to test for solubility and by circular dichroism spectroscopy to determine protein folding. The presence of expressed and soluble GalNAc-T2, WbgU and MUC1 was verified by SDS-PAGE and Western-blot analysis. Then, these three proteins were cloned into a single vector under the control of different promoters to verify their glycosylation directly in bacterial cells using the EnPresso® system for growth, which is a pre-sterilized growth medium designed to ensure slow and constant release. of glucose from a polysaccharide substrate.

Attualmente i maggiori sistemi di produzione di proteine glicosilate ad uso terapeutico si basano sull’utilizzo di cellule d’insetto o di mammifero in quanto in grado naturalmete di attuare le modifiche co/post traduzionali necessarie a garantire la funzionalità biologica della biomolecola. Tuttavia, questi sistemi di produzione risultano essere molto dispendiosi a causa degli elevati costi di costruzione e di gestione dei bioreattori industriali necessari allo scopo. Recentemente degli studi si stanno concentrando sull’utilizzo di ceppi di Escherica Coli per produrre proteine complesse, in quanto di questo organismo si ha una conoscenza molto approfondita sia del suo genoma che dei suoi processi di fermentazione, inoltre è possibile ottenere dei sistemi estremamente efficienti e economici che offrono alte rese su larga scala, permettendo di ottenere un prodotto purificato in breve tempo. Tuttavia la mancanza di modificazioni post-traduzionali come la glicosilazione in questo organismo ne determina un uso limitato in questo campo. La creazione di un sistema di espressione di E. Coli per la produzione di glicoproteine umane potrebbe potenzialmente portare ad un aumento dei rendimenti e ad una riduzione dei costi e dei tempi di produzione. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato cercare di costruire un sistema basato su E.coli che riesca ad apportare una O-glicosilazione. Questa tipo di glicosilazione consiste nel trasferimento delle porzioni di zucchero a un residuo di serina o treonina. Come proteina modello ci siamo focalizzati sulle mucine, queste sono glicoproteine ad alto peso molecolare secrete sulla superficie cellulare o sull'epitelio della mucosa negli animali e nell'uomo e forniscono uno scudo protettivo contro tossine e agenti patogeni. La O-glicosilazione delle mucine avviene tramite il trasferimento di GalNAc, ad opera delle UDP- N -acetilgalattosaminiltransferasi (GalNAc-Ts), che formano il collegamento GalNAcα1 - O -serina/treonina. Come linea cellulare è stato utilizzato un ceppo di E.coli competente progettato per avere un ambiente citoplasmatico più ossidante (Shuffe E.coli) contenente inoltre proteine atte alla formazione dei ponti disolfuro. Questo ceppo è stato ulteriormente modificato, per consentire l’espressione solubile della N -acetilgalattosaminiltransferasi 2 (GalNAc-T2) e della l'UDP-GlcNAc 4-epimerasi WbgU. Quest’ultima per consentire la conversione dell’uridina 5′-difosfo- N -acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) nell’uridina 5′-difosfo- N -acetilgalattosamina (UDP-GalNAc) nel citoplasma batterico in modo da garantire la presenza del substrato zuccherino nel ceppo di E. coli. Per valutare l’attività in vivo sia della glicosiltransferasi GalNAc-T2 che della 4-epimerasi WbgU in E. coli è stata scelto come target il polipeptide Mucina 1. Le sequenze di tutti e tre i geni clonati sono state modificate per eliminare eventuali siti di restrizione superflui e ottimizzate in base alla frequenza dei corrispettivi codoni di E.Coli. Inoltre per tutti e tre i geni è stata fusa una sequenza tag-SUMO all’N-terminale per aumentarne la solubilità. Le singole proteine sono state espresse e purificate in condizioni native per verificarne la solubilità e mediante a spettroscopia di dicroismo circolare per determinare il ripiegamento delle proteine. La presenza di GalNAc-T2, WbgU e della MUC1 espresse e solubili è stata verificata mediante analisi SDS-PAGE e Western-blot. Quindi, queste tre proteine sono state clonate in un singole vettore sotto il controllo di diversi promotori per verificarne la glicosilazione direttamente nelle cellule batteriche utilizzando per la crescita il sistema EnPresso® ossia un terreno di crescita pre-sterilizzato progettato per garantire un rilascio lento e costante di glucosio da un substrato polisaccaridico.