Progettazione e studio di varianti stabili del dominio PAS-B del fattore di trascrizione AhR (Aryl hydrocarbon Receptor)

Il recettore citoplasmatico AhR (aryl hydrocarbon receptor) appartenente alla famiglia di fattori di trascrizione bHLH-PAS è in grado di modulare diverse risposte in base ai diversi stimoli ambientali a cui è sottoposto. Il recettore AhR, infatti, attraverso il legame con molecole di varia natura, è in grado di traslocare nel nucleo inducendo l’attivazione di diversi meccanismi molecolari di risposta. Evidenze sempre maggiori mostrano il ruolo fondamentale svolto da AhR nel mantenimento dell’omeostasi cellulare; infatti, squilibri legati all’attività di AhR possono sfociare in disturbi infiammatori e neoplasie. Fondamentale per l’attività di AhR è il dominio di legame PAS-B (Per-ARNT-Sim). Questo dominio è in grado di legare diverse molecole come xenobiotici, idrocarburi arilici e contaminanti ambientali. L’interazione tra PAS-B e ligando è fondamentale per l’attivazione dei diversi meccanismi molecolari nucleari di risposta. Recentemente è stata pubblicata una struttura di un complesso della parte più ordinata di AhR ottenuta mediante la tecnica Cryo-EM (microscopia elettronica criogenica), che comprende anche il dominio PAS-B di nostro interesse. Il dettaglio atomico non è pero elevato, precludendo quindi analisi strutturali dettagliate. In particolare, per scopi di “rational drug design”, oltre ad una elevata risoluzione della struttura è molto importante poter ottenere informazioni strutturali in maniera rapida, dovendo confrontare quanti più complessi possibili tra il bersaglio e i vari ligandi sotto indagine, cosa non ancora possibile mediante Cryo-EM. Risulta, quindi, ancora di interesse riuscire a produrre il dominio PAS-B isolato e stabile, adatto per la cristallografia a raggi-X, tecnica che garantisce rapidità e accuratezza nell’acquisizione dell’informazione strutturale. Lo scopo di questo progetto di tesi è la progettazione e lo studio di nuove varianti del dominio di legame PAS-B che non manifestino gli evidenti problemi di stabilità e solubilità riscontrati in studi precedenti, a partire dalle informazioni strutturali fornite dalla struttura Cryo-EM del dominio umano e dalla struttura cristallografica del dominio di D. melanogaster. Si è partiti dal clonaggio in vettori plasmidici adeguati delle sequenze codificanti le forme mutate di PAS -B. Successivamente si sono effettuate una serie di prove di espressione in cellule di E. coli BL-21(DE3) cambiando diversi parametri al fine di ottenere PAS-B purificato attraverso l’ausilio di tecniche cromatografiche. In ultimo è stata posta l’attenzione all’utilizzo di tecniche di refolding per poter ottenere il dominio PAS-B partendo da corpi di inclusione e all’utilizzo di ceppi batterici contenenti sistemi che assistono il folding proteico (“chaperons”).