Cellule epiteliali derivate dalle urine di pazienti affetti da Glicogenosi di tipo 1a: un nuovo modello per lo studio di malattie metaboliche renali

Glycogenosis due to glucose-6-phosphatase 1 (G6P1) deficiency is a rare hereditary metabolic disease caused by the loss of functionality of the enzyme glucose-6-phosphatase (G6Pase), a key hydrolase in glucose metabolism, the gene of which is present in humans on chromosome 17 and expressed predominantly in the liver, intestine and kidney. The mutations (over 80) found in the gene of the catalytic portion of the G6Pase (G6PC) of patients affected by the disease, hindering the completion of the last step of gluconeogenesis and glycogenolysis, prevent the conversion of glucose-6-phosphate into glucose. This causes an accumulation of glycogen in the liver and kidney, causing liver and kidney complications, as well as anemia and osteopenia. Currently the only cure is a diet rich in slowly absorbed carbohydrates based on uncooked starch and corn; however, this diet is not totally decisive in preventing the effects deriving from the pathology in question, such as hyperlipidemia or growth retardation. In this study, some molecular and cellular mechanisms of the pathology were considered using cultures of UREC cells (Urinary-derived Renal Epithelial Cells), renal epithelial cells extracted from the urine of human patients. The procurement of cells is relatively simple as it presupposes the use of methods characterized by limited invasiveness and which represents the experimental model of the pathology. In collaboration with the Department of Medicine of the University of Padua, 6 lines of UREC cells obtained from 3 patients affected by the disease and 3 healthy subjects as controls were found and kept in culture. The cells were subjected to measurement of cell viability parameters (using the MTTS assay) and mitochondrial production/accumulation of reactive oxygen species (mROS, using the fluorometric probe dihydrorhodamine 123). Mitochondrial morphology and functionality were also analyzed (by treating the cells with Mitotracker® and quantifying Oxphos and Tom20). Furthermore, using Lipofectamine 3000, the plasmid carrying the G6PC gene was transfected, highlighting how these cells can be used for possible gene therapy. The preliminary studies have highlighted the considerable variability between the different samples examined which does not allow, at the moment, to draw definitive conclusions, as no significant differences were obtained between the GSD1a patients and the control ones, but which indicate that the UREC cells represent a good model to study rare genetic metabolic diseases associated with kidney disease.

La glicogenosi da deficit di glucosio-6-fosfatasi 1 (G6P1) è una malattia ereditaria metabolica rara causata dalla perdita della funzionalità dell’enzima glucosio-6-fosfatasi (G6Pasi), un’idrolasi chiave nel metabolismo del glucosio, il cui gene è presente nell’uomo sul cromosoma 17 ed espresso prevalentemente nel fegato, nell’intestino e nel rene. Le mutazioni (oltre 80) trovate nel gene della porzione catalitica della G6Pasi (G6PC) di pazienti affetti dalla patologia, ostacolando il completamento dell’ultimo step della gluconeogenesi e della glicogenolisi, impediscono la conversione del glucosio-6-fosfato in glucosio. Questo determina un accumulo di glicogeno nel fegato e nel rene causando complicanze epatiche e renali, oltre ad anemia ed osteopenia. Attualmente l’unica cura è una dieta ricca di carboidrati ad assorbimento lento a base di amido non cotto e mais; tuttavia, tale regime alimentare non è totalmente determinante nella prevenzione degli effetti derivanti dalla patologia in esame, quali iperlipidemia o ritardo nella crescita. In questo studio si sono considerati alcuni meccanismi molecolari e cellulari della patologia utilizzando colture di cellule UREC (Urinary-derived Renal Epithelial Cells), cellule epiteliali renali estratte da urine di pazienti umani. Il reperimento delle cellule è relativamente semplice poiché presuppone l’utilizzo di metodi caratterizzati da una limitata invasività e che rappresenta il modello sperimentale della patologia. In collaborazione con il Dipartimento di Medicina dell’Università di Padova, sono state reperite e tenute in coltura 6 linee di cellule UREC ricavate da 3 pazienti affetti dalla patologia e 3 soggetti sani come controllo. Le cellule sono state oggetto di misurazione dei parametri di vitalità cellulare (mediante il saggio MTTS) e di produzione/accumulo mitocondriale di specie reattive per l’ossigeno (mROS, mediante la sonda fluorometrica dihydrorhodamine 123). Si è analizzata anche la morfologia e funzionalità mitocondriale (trattando le cellule con Mitotracker® e quantificando Oxphos e Tom20). Inoltre, mediante lipofectamine 3000, si è trasfettato il plasmide portante il gene della G6PC, evidenziando come tali cellule possano essere usate per un'eventuale terapia genica. Gli studi preliminari hanno posto l’accento sulla notevole variabilità fra i diversi campioni esaminati che non consente, al momento, di trarre conclusioni definitive, in quanto non si sono ottenute differenze significative fra i pazienti GSD1a e quelli di controllo, ma che indicano che le cellule UREC rappresentano un buon modello per studiare le malattie metaboliche genetiche rare associate a patologie renali.