Mutagenesi sito-diretta e analisi funzionale dei residui di cisteina delle proteine flavodiiron di Physcomitrium patens

La fotosintesi ossigenica è un processo biochimico attuato da piante, alghe e cianobatteri attraverso cui l’energia luminosa viene convertita in molecole di carbonio inorganico e ossigeno. La fase strettamente luce dipendente della fotosintesi è mediata dalla catena di trasporto lineare degli elettroni. Il primo complesso, il fotosistema II (PSII), sfrutta l’energia luminosa per catalizzare la fotolisi dell’acqua. Gli elettroni prodotti dall'ossidazione dell'acqua vengono trasferiti mediante il pool dei plastochinoni al citocromo b6f (Cyt b6f) e successivamente al fotosistema I (PSI); la plastocianina (Pc) trasferisce gli elettroni alla ferredossina (Fd) e successivamente all'enzima ferredossina-NADP+ reduttasi (FNR) per produrre NADPH. Le reazioni di trasporto degli elettroni sono accoppiate all’accumulo di protoni nel lume dei tilacoidi e il gradiente protonico risultante viene sfruttato dall’ATP sintasi per produrre ATP. Sia l’ATP che il NADPH alimentano il Ciclo di Calvin-Benson (CCB) per la fissazione della CO2 e la produzione di molecole di carbonio inorganico. La luce è indispensabile per l’attività dei processi fotosintetici, tuttavia, la variazione di intensità luminosa, causa un accumulo di potere riducente che danneggia i fotosistemi e ne provoca la foto-inibizione. Per rispondere alla variazione di intensità luminosa, gli organismi fotosintetici hanno sviluppato diversi meccanismi che regolano la catena di trasporto degli elettroni (LEF). Fra i meccanismi più conservati osserviamo il trasporto pseudociclico (PCEF) detto anche “ciclo acqua-acqua” che può essere mediato dalla classe di enzimi delle flavodiiron proteins. Quest’ultime accettano gli elettroni a valle del fotosistema I (PSI) per ridurre l’ossigeno ad acqua ed evitare l’accumulo di elettroni sul PSI. Le FLV sono enzimi modulari costituite da tre domini: un dominio N-terminale β-lattamasico che coordina due ioni ferro, un dominio flavodoxin-like che coordina la flavina mononucleotide e un dominio C-terminale NAD(P)H:flavina ossidoreduttasico tipico degli organismi fotosintetici. Le FLV sono localizzate nello stroma dei tilacoidi e si attivano rapidamente per alcuni secondi in seguito a fluttuazioni di intensità luminosa, inoltre le sequenze amminoacidiche contengono un numero elevato di residui di cisteina. Si ipotizza perciò che le FLV siano regolate dallo stato redox dello stroma e che le cisteine potrebbero formare ponti disolfuro coinvolti in questo tipo di regolazione. Lo scopo di questo progetto è quello di indagare la funzione dei singoli residui di cisteina delle due proteine FLVA e FLVB appartenenti all’organismo modello Physcomitrium patens. Sulla proteina FLVB è stata effettuata una mutagenesi sito diretta su ciascuno dei nove codoni codificanti le cisteine che sono stati sostituiti con quelli per la serina. I nove plasmidi contenenti ciascuno la singola mutazione sono stati espressi in E.coli e le proteine sono state purificate tramite cromatografia di affinità. La qualità delle preparazioni è stata valutata attraverso la spettroscopia-UV, SDS-page e successivo Immunoblot. Mediante SDS page, in assenza di agente riducente, è stata osservata la formazione di complessi omo-multimeri nella forma 6 FLVB wt. Inoltre, sono stati costruiti i plasmidi per E.coli portanti la mutazione per gli amminoacidi che coordinano il ferro nel dominio β-lattamasico di FLVB per poter confermare il coinvolgimento dello ione nel trasferimento degli elettroni dall’ossigeno all’acqua. Parallelamente il plasmide contenente la doppia mutazione FLVAC443S-C682S è stato espresso all’interno della linea flva/b ko di Physcomitrium patens. Attraverso l’analisi della fluorescenza dei cloni trasformanti selezionati è stato possibile individuare le linee effettivamente complementanti da quelle che non esprimono una proteina funzionante e di verificare quindi la funzionalità del costrutto in vivo.