Design razionale di Nanobodies per il binding e l’inibizione di LexA nella risposta SOS di E. coli.

The SOS response is a conserved bacterial defense mechanism developed to counteract the effects of genotoxic stress, such as exposure to antibiotics. At the molecular level, this mechanism involves two proteins: RecA, which acts as a sensor for ssDNA formed as a consequence of stress, and LexA, a transcriptional repressor of SOS genes. During antibiotic exposure, RecA becomes activated and polymerizes. This allows it to form a complex with LexA, leading to LexA's autoproteolysis, which in turn enables the expression of SOS genes that code for factors allowing bacterial survival, promoting the accumulation of mutations that contribute to the development of resistance. Antibiotic resistance in bacteria is a widespread issue, largely caused by the massive and improper use of antibiotics. One solution is to suppress the SOS mechanism. One approach being investigated is the use of Nanobodies to prevent LexA autoproteolysis. Two Nanobodies (NbSOS1 and NbSOS3) have been investigated and engineered to obtain various mutants to optimize their binding with LexA and their inhibitory power. In this work, the designed mutants were obtained through the expression of the corresponding recombinant proteins and protein purification chromatographic techniques. They were then tested to estimate the inhibition of LexA autoproteolytic cleavage in the presence of RecA using fluorescence polarization assays: this approach allowed the identification of the two best mutants in terms of cleavage inhibition, namely NbSOS1C and NbSOS3I. From here, crystallographic techniques were employed, where each mutant was incubated with the CTD domain of LexA and subjected to crystallization tests: the crystallographic data obtained will be used to visualize the structure of the LexA-Nb complex and define the impact of the modifications introduced in the interaction region between the two. This was followed by Surface Plasmon Resonance experiments to accurately estimate the affinity between the Nanobodies and LexA.

La risposta SOS è un meccanismo di difesa batterico conservato e sviluppato per contrastare gli effetti da stress genotossico, come nel caso degli antibiotici ai quali sono esposti i batteri. A livello molecolare il meccanismo vede coinvolte due proteine: RecA che funge da sensore nei confronti del ssDNA, formatosi come conseguenza allo stress, e LexA, un repressore trascrizionale dei geni SOS. Durante l’esposizione ad antibiotico RecA va incontro ad attivazione e polimerizza. In questo modo è capace di formare un complesso con LexA, che va incontro ad autoproteolisi, consentendo l’espressione dei geni SOS codificanti per fattori che permettono la sopravvivenza del batterio, favorendo un accumulo di mutazioni che favoriscono l’insorgere della resistenza. L’antibiotico resistenza nei batteri è un problema molto diffuso, causato in buona parte da un uso massivo ed improprio degli antibiotici: una delle soluzioni è quella di reprimere il meccanismo SOS. Uno degli approcci che si sta investigando è quello di utilizzare Nanobodies per impedire l’autoproteolisi di LexA. Due Nanobodies sono stati investigati (NbSOS1 e NbSOS3) e ingegnerizzati in modo da ottenere diversi mutanti al fine di ottimizzare il binding con LexA ed il loro potere inibente. In questo lavoro sono stati ottenuti i mutanti così progettati tramite espressione delle corrispondenti proteine ricombinanti e tecniche cromatografiche di purificazione proteica. Sono stati quindi testati in modo da stimare l’inibizione del taglio autoproteolitico di LexA di E. coli in presenza di RecA attraverso saggi di polarizzazione di fluorescenza: grazie a tale approccio si sono potuti trovare i due mutanti migliori dal punto di vista dell’inibizione del taglio, ovvero NbSOS1C e NbSOS3I. Da qui si è proceduto con tecniche di cristallografia, dove si è incubato ogni mutante con il dominio CTD della LexA e sottoposto a test di cristallizzazione: i dati cristallografici ottenuti serviranno per visualizzare la struttura del complesso LexA-Nb e definire l’impatto delle modificazioni introdotte nella regione di interazione tra i due. Si è proseguito poi con esperimenti di Surface Plasmon Resonance per stimare con accuratezza l’affinità tra i Nanobodies e LexA.