Analisi mediante RNA-seq dell’espressione relativa di RNA circolari rispetto ai trascritti lineari del gene ospite nella Leucemia Linfocitica Cronica con t(14;19)

Abstract Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a prevalent and complex hematological malignancy with a significant impact on patient health and despite numerous advancements in treatment modalities, it remains an incurable condition. Circular RNAs (circRNAs) have recently emerged as a fascinating class of non-coding RNAs that possess diverse regulatory functions in various cellular processes and diseases including cancer. Accumulating evidence suggests that circRNAs can exert their biological functions by interacting with other RNA molecules and proteins, and even through their translation into functional peptides. Given their unique circular structure, circRNAs may play critical roles in the dysregulation of gene expression and the development of cancer. While circRNAs have been abundantly detected in the hematopoietic compartment, their specific roles and diversity among different blood cell types, particularly in the context of CLL, remain poorly understood. This thesis aimed to comprehensively explore the differential expression patterns of circRNAs comparing Chronic lymphocytic leukemia (CLL), CLL cases with aggressive disease-bearing t(14;19)(q32;q13) rearrangement, and B-cells from healthy donors. However, instead of focusing solely on how the absolute read counts change in each condition, our emphasis is on understanding how the abundance of the circular form changes relative to the linear form. Concentrating on significant changes in circular to linear proportion (CLP) is crucial for unraveling the dynamic shifts across different states. Furthermore, an additional aspect involves investigating the presence and abundance of Mitochondrion-encoded circular RNA in these conditions. This exploration into Mitochondrion-encoded circular RNA adds a complementary dimension to the study, potentially revealing insights into their potential roles alongside the broader landscape of circRNAs in CLL pathogenesis. To accomplish the objective, we utilized the CirComPara2 methodology to analyze RNA-sequencing data sourced from a cohort of 47 CLL patients, 25 CLL exhibiting and 22 without the BCL3 translocation, and a control group comprising 9 healthy donors. We identified specific circRNAs that show a meaningful difference in circular to linear proportions among conditions and could play a role in the processes associated with CLL pathogenesis and influenced by the t(14;19)(q32;q13) rearrangement, which can be further explored as diagnostic or prognostic biomarkers in the future. Our findings indicate that certain circRNAs may contribute to leukemogenesis by interacting with microRNAs. A deeper understanding of the intricate relationships among circRNAs, mRNAs, miRNAs, and CLL pathophysiology holds promise for unveiling novel therapeutic strategies, potentially leading to personalized medicine approaches.

Riassunto La leucemia più diffusa nei paesi Occidentali è la Leucemia Linfocitica Cronica (CLL), una malattia ematologica complessa ed eterogenea. Nonostante i miglioramenti nelle terapie, la CLL impatta sulla salute dei pazienti ed è ancora oggi una malattia sostanzialmente incurabile. Gli RNA circolari (circRNA) sono emersi abbastanza recentemente quale nuova e interessante classe di RNA prevalentemente non codificanti ma con ruoli regolativi in svariati processi cellulari e nelle patologie, incluse quelle tumorali. Proprio la loro struttura circolare fa sì che questi RNA siano stabili e possano agire come regolatori dell’espressione genica nello sviluppo dei tumori. Evidenze recenti stanno mostrando che i circRNA svolgono la loro funzione mediante interazione con altri RNA oppure con proteine, mentre solo alcuni circRNA codificano peptidi funzionali. Gli RNA circolari sono abbondantemente espressi nel comparto ematopoietico, ma i ruoli della maggior parte di essi in diversi tipi e stadi di maturazione delle cellule del sangue, e anche nel contesto della CLL, sono ancora poco conosciuti. Questa tesi mira all’esplorazione dettagliata dei profili di espressione differenziale degli RNA circolari nella CLL, ed in un sottotipo particolarmente aggressivo di questa patologia, recentemente associato alla traslocazione t(14;19)(q32;q13) causante sovraespressione del fattore di trascrizione BCL3, in confronto con la controparte normale rappresentata delle cellule B di donatori sani. Oltre a considerare l’espressione assoluta degli RNA circolari, le analisi si focalizzano particolarmente su quella relativa, ovvero sui cambiamenti del livello d’espressione degli RNA circolari rispetto alla controparte lineare prodotta dallo stesso gene. Significativi cambiamenti nella “proporzione circolare su lineare” (circular to linear proportion, CLP) permettono di descrivere diversi stati cellulari. Inoltre, in questa tesi è stato preso in considerazione un tipo particolare di circRNA identificato solo molto recentemente: gli RNA circolari codificati dal genoma mitocondriale, andando a fornire una visione più ricca e multidimensionale delle alterazioni del trascrittoma della CLL. Per raggiungere questi obiettivi, è stato usato il software CirComPara2 per analizzare i dati RNA-seq di una coorte di 47 pazienti con CLL, 22 con la traslocazione che coinvolge BCL3, 22 senza, e 9 di cellule B di controlli sani. Abbiamo identificato specifici circRNA con un CLP alterato nella CLL in generale oppure in associazione con la t(14;19)(q32;q13) e il cui ruolo in questa patologia, e la rilevanza come marcatori diagnostici e prognostici, dovrà essere studiato in futuro. Studi esplorativi svolti in questa tesi indicano che alcuni dei circRNA identificati potrebbero agire legandosi a microRNA impedendo la funzione soppressoria di questi sull'espressione genica. Ulteriori indagini potranno essere condotte per indagare invece possibili interazioni tra circRNA e RNA messaggeri e il ruolo di queste nella CLL, con l’obiettivo di comprendere meglio gli aspetti molecolari di questa patologia nell’ottica di facilitare lo sviluppo di migliori e personalizzate terapie in futuro.