PRODUZIONE E CARATTERIZZAZIONE DELLE LIPOSSIGENASI RICOMBINANTI LOX2 E LOX7 DA VITIS VINIFERA

Questo elaborato di tesi ha come obiettivo la sintesi, la purificazione e lo studio dell’attività catalitica di due proteine, Lox2 e Lox7. La famiglia di Lipossigenasi interviene in processi di maturazione, segnalazione e apoptosi nella specie Vitis vinifera e ha azione perossidante su substrati come acido linoleico e acido linolenico, nonché acido jasmonico, largamente diffuso nel mondo vegetale. All’inizio del percorso sperimentale la sequenza amminoacidica delle due proteine era già nota e la tecnica di produzione era già teoricamente messa a punto; si trattava di utilizzare dei primer a DNA già ottimizzati da un laboratorio esterno per inserirli all’interno di un plasmide di Escherichia coli. Attraverso la tecnica PCR si è proceduto alla sintesi esponenziale di codice genetico plasmidico modificato che è stato successivamente inserito all’interno di una piccola colonia di E. coli. Una volta verificata l’effettiva modifica del codice genetico attraverso tecniche come la Elettroforesi, si è proceduto alla crescita delle colonie fino a che la duplicazione fosse ancora in una fase esponenziale, per poi indurre molto velocemente la sintesi proteica attraverso lo sblocco dell’operone lac. L’idea è stata quella di stressare il batterio in modo da imporgli una rapida sintesi proteica in cui venisse tradotto anche il codice genetico innestato. Una volta saturata la soluzione batterica e proteica si è dunque proceduto con le tecniche di purificazione a partire dalla Sonicazione fino alla IMAC in modo da ottenere un prodotto il più pulito possibile che consentisse il proseguimento dello studio. Ottenuto il materiale proteico, si sono eseguiti saggi di attività a pH e substrati diversi in modo da identificare quali fossero le condizioni di reazione preferite dall’una e dall’altra proteina e quale fosse la loro efficienza catalitica. A sostegno di questi studi sono stati utilizzati strumenti come gli spettrofotometri, lo HPLC-MS e l’NMR.