Generation and functional characterization of a zebrafish mutant line for the ASD-related gene syngap1b

Autism Spectrum Disorders (ASD) are forms of developmental disability characterized by heterogeneous etiology and several degrees of severity. In particular, a complex genetic background paves the way to different phenotypes which reflect impairments in social interactions, sensory processing, motor coordination, and visuo-motor adaptation. Because of this genetic heterogeneity, the ASD non-syndromic scenario is still not fully comprehended and, to date, there are no adequate and mirate therapies in treating the core symptoms. One important human gene whose mutations are frequently found in association with ASD, is SYNGAP1, encoding a Ras GTPase activating protein present in the PSD of excitatory glutamatergic synapses as part of a complex with N-methyl-D-aspartate receptors. For investigating the link between the genetic background and the symptomatic profile of ASD, and establishing causal relationships characterizing the pathological mechanisms, it is possible to take advantage of the modern transgenesis techniques to develop animal models carrying specific gene mutations. In this scenario, zebrafish is an optimal model organism thanks to the genetic closeness with human beings, the relatively low maintenance cost, and rapid life cycle. For this thesis work, I established a zebrafish syngap1b mutant line using the genome editing strategy based on CRISPR-Cas9. The morphological characterization revealed a distinct developmental delay in homozygous larvae, with a reduction in body length and brain size. Functional characterization showed a particular increase in cell death in syngap1b-/- embryos during stainings with the organic compound acridine orange. Moreover, an increase in proliferating cells in syngap1b-/- embryos has been observed with other immunofluorescence stainings with an anti-PHH3 antibody. In ASD patients, altered sensory processing represents an important phenotype together with the epileptic one frequently related to mutations in SYNGAP1. Locomotor dark/light assays have been conducted revealing in homozygous larvae an increase in swimming activity in terms of total distance traveled, either considering the dark or the light phases separately. Furthermore, a specific locomotor assay is performed to assess motor activity in response to an abrupt change in the environment luminance, revealing fast darting movements characterizing homozygous animals. These promising results consented to assert that this mutant line recapitulates some aspects of the symptomatic profile characterizing the ASD pathology and that the line could serve as a valuable model for studying the disorder.

I disturbi dello spettro autistico (ASD) sono forme di disabilità dello sviluppo caratterizzate da eziologia eterogenea e diversi gradi di gravità. In particolare, un complesso background genetico apre la strada a diversi fenotipi che riflettono alterazioni nelle interazioni sociali, nell'elaborazione sensoriale, nella coordinazione motoria e nell'adattamento visuo-motorio. A causa di questa eterogeneità genetica, lo scenario non sindromico dell’ASD non è ancora pienamente compreso e, ad oggi, non esistono terapie adeguate e mirate nel trattamento dei sintomi principali. Un importante gene umano le cui mutazioni si riscontrano frequentemente in associazione con l'ASD, è SYNGAP1, che codifica per una proteina attivante Ras GTPasi presente nella densità post-sinaptica (PSD) delle sinapsi glutammatergiche eccitatorie come parte di un complesso con i recettori N-metil-D-aspartato. Per indagare il legame tra lo sfondo genetico e il profilo sintomatico dell'ASD e stabilire le relazioni causali che caratterizzano i meccanismi patologici, è possibile sfruttare le moderne tecniche di transgenesi per sviluppare modelli animali portatori di specifiche mutazioni genetiche. In questo scenario, zebrafish rappresenta un organismo modello ottimale grazie alla vicinanza genetica con gli esseri umani, ai costi di manutenzione relativamente bassi e al rapido ciclo di vita. Per il lavoro di questa tesi, ho creato una linea mutante di zebrafish per il gene syngap1b, utilizzando la strategia di editing genomico basata su CRISPR-Cas9. La caratterizzazione morfologica ha rivelato un netto ritardo dello sviluppo delle larve omozigoti, con una riduzione della lunghezza del corpo e delle dimensioni del cervello. La caratterizzazione funzionale ha mostrato un particolare aumento della morte cellulare negli embrioni syngap1b-/- durante le colorazioni con arancio di acridina. Inoltre, è stato osservato un aumento delle cellule proliferanti con altre colorazioni di immunofluorescenza usando un anticorpo contro il fosfoistone H3 (PHH3). Nei pazienti con ASD, l'alterata elaborazione sensoriale rappresenta un fenotipo importante insieme a quello epilettico frequentemente correlato a mutazioni in SYNGAP1. Nelle larve omozigoti, test locomotori alla luce e al buio hanno rivelato un aumento del nuoto in termini di distanza totale percorsa, considerando separatamente le fasi di luce e di buio. Inoltre, altri test specifici per valutare l'attività motoria in risposta a un brusco cambiamento nella luminanza dell'ambiente hanno mostrato movimenti rapidi e guizzanti. Questi risultati promettenti hanno consentito di affermare che la nostra linea mutante ricapitola alcuni aspetti del profilo sintomatico caratterizzante l’ASD e che potrebbe perciò servire come un valido modello per lo studio di questa patologia.