Produzione di L-teanina in Synechocystis sp. PCC6803 mediante espressione dell’enzima GMAS (γ-glutamylmethylamide synthetase) di Methylovorus mays: dimostrazione di fattibilità

Synechocystis is a genus of cyanobacteria that has been extensively studied and used in recent years as a cell factory for whole-cell biocatalysis. This photoautotrophic bacterium has several advantages: ease of genetic manipulation, cost-effectiveness in culture maintenance as it is photoautotrophic, and the ability to regenerate the cofactor NADPH. This thesis project had a dual focus. The initial goal was to obtain crystals of the enzyme Gamma-glutamylmethylamide synthetase from Methylovorus mays (MmGMAS). The second objective was to study the enzyme's possible application in the development of a biocatalytic process for whole-cell catalysis using a strain of Synechocystis (sp. PCC 6803) as its host. MmGMAS is an ATP-dependent enzyme that catalyzes the formation of a bond between L-Glutamate and Ethylamine, producing L-Theanine, a non-proteinogenic amino acid with numerous applications in the nutraceutical field. To obtain MmGMAS crystals, a liquid culture of an E. coli strain transformed with a plasmid for the expression of the heterologous enzyme was set up. Once the purification protocol was optimized, the enzyme was purified, concentrated, distributed into crystallization plates, and some of the obtained crystals were selected for X-ray analysis. Simultaneously, the MmGMAS coding sequence was cloned into an integrative plasmid for expression in Synechocystis, and the transgenic strain Syn_MmGMAS was obtained. After verifying the actual expression of the enzyme through Western Blot and the maintenance of its catalytic activity via TLC and MS, various growth curves were set up to check whether the enzyme, substrates, product, or the reaction itself had any effects on cell viability. Subsequently, the Syn_MmGMAS strain was characterized both from a photosynthetic point of view, showing higher photosynthetic efficiency than the control, and from a biochemical perspective, through the setup of biotransformations at different substrate concentrations. It is important to highlight that no one had ever expressed an ATP-dependent enzyme in Synechocystis before; therefore, this study represents a proof-of-concept, currently new in the literature, for the functioning of a heterologous ATP-dependent enzyme in Synechocystis. Finally, the plasmid pSuperP_MmGMAS_CsAlaDC_CmR was constructed with the aim of obtaining, in the future, a strain able to synthesize L-Theanine without the need to add substrates to the culture medium.

Synechocystis è un genere di cianobatteri molto studiato e utilizzato negli ultimi anni come cell-factory per la biocatalisi a cellule intere (whole-cell). Questo batterio fotoautotrofo, infatti, possiede diversi vantaggi: facilità di manipolazione genetica, economicità di mantenimento in coltura essendo fotoautotrofo e capacità di rigenerare il cofattore NADPH. In questo progetto di tesi ci si è dapprima concentrati sull’ottenimento di cristalli dell’enzima Gamma-glutamylmethylamide synthetase di Methylovorus mays (MmGMAS) e successivamente è stata studiata la sua possibile applicazione nello sviluppo di un processo biocatalitico di whole-cell catalysis utilizzando come ospite un ceppo di Synechocystis (sp. PCC 6803). MmGMAS è un enzima ATP-dipendente che catalizza la formazione del legame tra L-Glutammato ed Etilammina producendo L-Teanina, un amminoacido non proteogenico con numerose applicazioni in campo nutraceutico. Al fine di ottenere cristalli di MmGMAS è stata allestita una coltura liquida di un ceppo di E. coli trasformato con un plasmide per l’espressione dell’enzima eterologo. Una volta ottimizzato il protocollo di purificazione, l’enzima è stato purificato, concentrato, distribuito in piastre per la cristallizzazione ed alcuni cristalli ottenuti sono stati selezionati per l’analisi ai raggi X. Parallelamente è stato clonata la sequenza codificante MmGMAS in un plasmide integrativo per l’espressione in Synechocystis e si è ottenuto il ceppo transgenico Syn_MmGMAS. Dopo aver verificato l’effettiva espressione dell’enzima tramite Western Blot e il mantenimento della sua capacità catalitica tramite TLC e MS, sono state allestite diverse curve di crescita per verificare se l’enzima, i substrati, il prodotto o la reazione in sé avessero degli effetti sulla vitalità cellulare. In seguito, il ceppo Syn_MmGMAS è stato caratterizzato sia dal punto di vista fotosintetico, dimostrando di avere un’efficienza fotosintetica maggiore del controllo, che sotto il profilo biochimico, tramite l’allestimento di biotrasformazioni a diverse concentrazioni di substrati. È fondamentale sottolineare che nessuno prima d’ora aveva mai espresso un enzima ATP-dipendente in Synechocystis, pertanto, questo studio rappresenta una proof-of-concept, ad oggi nuovo in letteratura, per il funzionamento di un enzima eterologo ATP-dipendente in Synechocystis. Infine, è stato costruito il plasmide pSuperP_MmGMAS_CsAlaDC_CmR con lo scopo di ottenere in futuro un ceppo capace di sintetizzare L-Teanina senza l’aggiunta di substrati al mezzo di coltura.