Implementazione di una sonda fluorescente sensibile al pH in Anabaena sp. PCC 7120

I cianobatteri diazotrofi sono organismi in grado di svolgere la fotosintesi, processo tramite il quale convertono l’energia solare in energia chimica, e la fissazione dell’azoto, con cui convertono l’azoto molecolare (N2) presente nell’atmosfera in forme biodisponibili per i sistemi biologici. Queste caratteristiche li rendono cruciali per i cicli biogeochimici del carbonio e dell’azoto. La fotosintesi e la fissazione dell’azoto sono due processi che dipendono uno dai prodotti dell’altro. Infatti, gli scheletri carboniosi, l’energia (ATP) ed il potere riducente (NADPH) prodotti dalla fotosintesi sono necessari al metabolismo dell’azoto, che a sua volta produce proteine e pigmenti utili al metabolismo del carbonio. Questo legame si traduce nella necessità di una fine regolazione del loro equilibrio, per garantire efficienza e mantenimento dell’omeostasi. La fotosintesi avviene nelle cellule vegetative, mentre la fissazione dell’azoto è eseguita dalla nitrogenasi, un enzima altamente sensibile all'ossigeno che pertanto richiede un ambiente microssico per funzionare. In alcune specie di cianobatteri diazotrofi, quindi, in condizioni di carenza di azoto alcune cellule vegetative si differenziano in eterocisti, cellule specializzate proprio nella fissazione dell’azoto. Queste due tipologie cellulari stabiliscono un rapporto reciproco dovuto all’interdipendenza tra i rispettivi metabolismi, rendendo i cianobatteri diazotrofi estremamente utili per studiare questa relazione. Comprendere i meccanismi alla base della regolazione del metabolismo del carbonio e dell’azoto in questi organismi risulta molto importante dato il fondamentale ruolo ecologico che essi ricoprono. Ciò può anche avere significative implicazioni socio-economiche, come il miglioramento della capacità di prevedere e gestire le sempre più problematiche fioriture algali, oppure lo sviluppo di prodotti innovativi come fertilizzanti biologici, con potenziali benefici per l'agricoltura sostenibile. In questo contesto, la misura del pH intracellulare rappresenta un'importante risorsa per comprendere e monitorare la fotosintesi e la fissazione dell’azoto nei cianobatteri diazotrofi. Infatti, esso è un parametro chimico-fisico che influisce sull'attività biologica modulando l'attività degli enzimi. Inoltre, durante la fotosintesi i protoni (H+) si muovono tra il citoplasma e il lume tilacoidale, per via dell’attività del citocromo b6f e della ATP-sintasi, andando ad influenzare dunque direttamente l’acidità dei due compartimenti. Per questi motivi, il lavoro è stato finalizzato allo sviluppo di un metodo sperimentale per misurare il pH intracellulare in cianobatteri diazotrofi, che fosse sensibile a variazioni luce-dipendenti. Per perseguire questo obiettivo, ho scelto di lavorare con l'organismo Anabaena sp. PCC 7120, un cianobatterio filamentoso che in condizioni di carenza di azoto sviluppa le eterocisti. Per monitorare i cambiamenti di pH distintamente nelle cellule vegetative e nelle eterocisti, ho utilizzato la sonda fluorescente pH-GFP, sviluppata in origine da G. Miesenbock nel 1998, esprimendola sotto il controllo del promotore della RUBISCO e del promotore della PLASTOCIANINA. Inizialmente, ho verificato le condizioni ottimali per l’espressione della sonda, testando l’inducibilità dei promotori alle condizioni ambientali. Successivamente ho calibrato il funzionamento della sonda, ed infine ho eseguito degli esperimenti e delle osservazioni al microscopio confocale per dimostrare il funzionamento del sistema per monitorare le variazioni di pH, e la possibilità di distinguere queste variazioni tra diverse cellule. I risultati dimostrano che il sistema è inducibile, efficace ed attendibile per misurare le variazioni di pH distintamente nelle due tipologie cellulari di Anabaena sp. PCC 7120.