Produzione di bio-indaco in Synechocystis sp. PCC 6803 mediante biocatalisi whole-cell

In the current historical context afflicted by severe climate change, the need to develop eco-friendly and sustainable industrial processes has led more and more chemical companies to turn their attention to biocatalytic processes that vaunt these characteristics. Even if bio-processes exploiting isolated enzymes prevail, through metabolic engineering and synthetic biology, it is possible to reproduce entire synthetic pathways, or parts of them, in a single cellular system that offers several advantages. In recent years, this branch of biocatalysis that uses so-called whole-cell systems has identified many organisms, especially microorganisms, as potential platforms for the production of a wide range of industrially relevant products, both natural and non-natural. Particular attention is given to cyanobacteria, a group of photosynthetic prokaryotes, with a natural competence for the integration of exogenous DNA and a certain efficiency of homologous recombination. These characteristics have made cyanobacteria excellent candidates for the study of photo-biocatalytic processes over the years. In this thesis project, the possibility of producing indigo (a dye widely used in the textile industry) from indole has been demonstrated through biocatalysis mediated by a transgenic strain of Synechocystis sp. PCC 6803 expressing a heterologous flavin-dependent monooxygenase, derived from Methylophaga aminisulfidivorans (FMO, flavin-containing monooxygenase). Once established the ability of the Syn_FMO strain to produce the pigment of interest, this thesis delves into the cytotoxic effects of the substrate and product; subsequently, the work focused on the optimization of the yield of the biotransformation (on a small scale) and to facilitate the recovery of the highly hydrophobic product is reported. Finally, preliminary studies on the implementation of the synthetic pathway to expand the potential and sustainability of the process will be discussed.

Nell’attuale quadro storico afflitto da gravi cambiamenti climatici, la necessità di sviluppare processi industriali eco-compatibili e sostenibili fa sì che sempre più imprese chimiche volgano lo sguardo verso i processi biocatalitici. Sebbene prevalgano i bio-processi che sfruttano enzimi isolati, mediante l’ingegneria metabolica e la biologia sintetica è possibile riprodurre intere vie di sintesi, o parti di queste, in un solo sistema cellulare che offre numerosi vantaggi. Negli ultimi anni questo ramo della biocatalisi che sfrutta sistemi cosiddetti whole-cell ha individuato numerosi organismi, soprattutto microorganismi, impiegabili come possibili piattaforme per la produzione di un’ampia gamma di prodotti di interesse industriale, naturali e non. Particolare attenzione è rivolta ai cianobatteri, un gruppo di procarioti fotosintetici, con naturale competenza all’integrazione di DNA esogeno e relativa efficienza di ricombinazione omologa. Queste caratteristiche hanno reso i cianobatteri ottimi candidati per lo studio di processi foto-biocatalitici. In questo progetto di tesi è stata dimostrata la possibilità di produrre indaco (colorante ampiamente utilizzato nell’industria tessile), a partire da indolo, con la biocatalisi mediata da un ceppo transgenico di Synechocystis sp. PCC 6803 che esprime una monoossigenasi dipendente da flavina eterologa, derivata da Methylophaga aminisulfidivorans (FMO, flavin-containing monooxygenase). Assodata la capacità del ceppo Syn_FMO di produrre il pigmento di interesse, in questa tesi viene approfondito l’effetto citotossico di substrato e prodotto; successivamente viene riportato il lavoro condotto ai fini di ottimizzare la resa della biotrasformazione (in piccola scala) e di facilitare il recupero del prodotto di per sé altamente idrofobico. Infine saranno descritti esperimenti preliminari orientati all’implementazione del pathway di sintesi per ampliare le potenzialità del processo e la sua sostenibilità.