Caratterizzazione dell’affinità di varianti ingegnerizzate di albumina verso ligandi di interesse farmacologico e studi di tossicità su cellule primarie umane

L’albumina sierica umana (hSA) è la proteina di trasporto più abbondante presente nel plasma ed interagisce con numerosi ligandi, tra cui vi sono alcuni acidi grassi per i quali hSA presenta nove siti di binding. Due di tali siti (Sudlow’s site I e Sudlow’s site II) sono di maggiore interesse per il legame con farmaci quali ibuprofene e warfarin. La rilevanza di tale proteina è relativa al suo potenziale impiego nel delivery di farmaci; infatti, hSA presenta una lunga emivita (circa 3 settimane) nel circolo sanguigno grazie al sistema di riciclo a livello renale che sfrutta l’interazione col recettore Fc neonatale (hFcRn). A tal proposito i ricercatori del gruppo israeliano del Weizmann Institute of Science, mediante l’algoritmo PROSS, hanno progettato in silico tre varianti di hSA esprimibili in Escherichia coli con un’elevata resa e altamente stabili dal punto di vista termico. In questo progetto di tesi sono stati studiati in modo approfondito tali mutanti di hSA, con una prospettiva di impiego di tali proteine nel drug delivery. Dopo aver ottimizzato il protocollo di produzione e purificazione di tali varianti nel ceppo T7 Shuffle di E. coli, sono state compiute misure di affinità sfruttando la tecnica calorimetrica dell’ITC (Isothermal titration calorimetry) con interattori noti di hSA wild-type come warfarin e ibuprofene. È stata poi testata la citotossicità di tali albumine su cellule monocitarie umane, differenziate in macrofagi, sottoponendo tali cellule ad una concentrazione pari a 0,4 ug/uL di hSA mutanti precedentemente trattate con un protocollo di rimozione di LPS.