Deoxynucleotide metabolism in "naive" and "primed" pluripotent stem cells and generation of a CRISPRi Cas9-KRAB cell line targeting DGUOK

Human pluripotent stem cells (hPSCs), characterized by self-renewal and capacity of differentiating into three germ layers, hold great potential in studies on developmental biology and clinical practice. However, PSCs can acquire genetic and epigenetic changes during prolonged culture in vitro which can convey a selective advantage, resulting in a shift in the population toward abnormal cells. Defects in dNTP metabolism may contribute to genome instability detected in PSCs since replication and repair of DNA require adequate and balanced amounts of each deoxynucleotide (dNTP). Nevertheless, current understanding of dNTP metabolism in both mouse and human PSCs is still limited. In the present study we used RNA seq transcriptome analyzes and quantitative real- time PCR to investigate gene expression profile of fundamental genes coding for mitochondrial and cytosolic enzymes for dNTP metabolism in both human naïve and primed PSCs. In addition, gene expression analysis was integrated at cellular level by measuring dNTP pool content and composition in both pluripotent states. Our data suggest a peculiar mitochondrial dNTP metabolism in primed PSCs where purine dNTP synthesis is favored over pyrimidine ones. To investigate this aspect further, we decided to use a CRISPR interference approach to evaluate the effects of genetic inhibition of mitochondrial enzymes in primed PSCs. This line of research will help to clarify whether mitochondrial dNTP metabolism plays a role in mtDNA maintenance and in the metabolic transition from naïve to primed pluripotent stem cells.

Le human Pluripotent Stem Cells (hPSCs), caratterizzate da capacità di autorinnovamento e differenziazione nei tre strati germinali, hanno un grande potenziale per lo studio della biologia dello sviluppo e nella pratica clinica. Tuttavia, le hPSCs possono accumulare mutazioni genetiche e cambiamenti epigenetici durante la coltura prolungata in vitro, che possono portare ad un vantaggio selettivo, con conseguente spostamento della popolazione verso cellule anormali. I difetti nel metabolismo dei deossinucleotidi (dNTP) possono contribuire all'instabilità del genoma rilevata nelle hPSCs poiché la replicazione e la riparazione del DNA richiedono quantità adeguate e bilanciate di ciascun dNTP. Ciononostante, la comprensione attuale del metabolismo dei dNTP nelle hPSCs, sia di topo che umane, è ancora limitata. Nel presente studio abbiamo utilizzato le analisi del trascrittoma di tipo RNA seq e qPCR per indagare il profilo di espressione genica di geni fondamentali che codificano per enzimi mitocondriali e citosolici coinvolti nel metabolismo dei dNTP nelle hPSCs naïve e primed. Inoltre, l'analisi dell'espressione genica è stata integrata a livello cellulare misurando il contenuto e la composizione del pool dei dNTP in entrambi gli stati di pluripotenza. I nostri dati suggeriscono un peculiare metabolismo dei dNTP mitocondriali nelle hPSCs primed, in cui la sintesi dei dNTP purinici è favorita rispetto a quelli pirimidinici. Per approfondire questo aspetto, abbiamo deciso di utilizzare un approccio di interferenza basato su CRISPR per valutare gli effetti dell'inibizione genica degli enzimi mitocondriali nelle hPSCs primed. Questa linea di ricerca aiuterà a chiarire se il metabolismo mitocondriale dei dNTP ha un ruolo nel mantenimento del DNA mitocondriale e nella transizione metabolica da cellule staminali pluripotenti naïve a primed.