Evaluation of the effects of combined decellularization and cryopreservation on the morphological and ultrastructural characteristics of human tracheal grafts

Finding an adequate tracheal substitute is a significant challenge in thoracic surgery. Research suggests that decellularized natural scaffolds can effectively show a reduced immunogenicity; however, current decellularization methods are invasive and carry risk of tissue damage. Furthermore, cryopreservation techniques seem to decrease tissues immunogenicity, but evidences are still scant. Within this context, this thesis focused on developing decellularized human tracheal grafts (in collaboration with FBTV - Fondazione Banca dei Tessuti del Veneto), and combine decellularization treatment with cryopreservation, to assess the impact of the two strategies together, over trachea characteristics. Following macroscopic comparison, residual nuclei/DNA evaluation (DAPI, DNA quantitative analysis) and histological analyses (hematoxylin and eosin/Masson’s Trichrome staining/Sirius Red staining/Van Gieson staining/Alcian Blue staining) allowed to assess the tissues overall characteristics and the extracellular matrix. Glycosamminoglycans were also quantified. For a deeper understanding of ultrastructural and mechanical properties, SEM imaging and compression tests were carried out. Overall, study results proved both decellularization protocol effectiveness (DNA˂50 ng/mg tissue; preserved ECM protein and mechanical properties) and the positive impact guaranteed by cryopreservation in preserving the tissue without affecting the tissue. The decellularization protocol assayed here, together with cryopreservation may lead to promising tracheal substitutes to be used in clinical practice.

Ad oggi, l’identificazione di un sostituto tracheale adeguato per i pazienti con lesioni tracheali severe costituisce una sfida importante in ambito clinico chirurgico. Le strategie terapeutiche esistenti, come l'uso di stent o le anastomosi termino-terminali, presentano limiti significativi sia nel breve che nel lungo periodo. Idealmente, un sostituto tracheale adeguato deve presentare: biocompatibilità, per una sua integrazione efficace con il tessuto circostante; pervietà del lume, al fine di garantire la respirazione; rigidità laterale e flessibilità longitudinale, per consentire i movimenti del collo e prevenirne il collasso; riproducibilità su larga scala e, soprattutto, assenza di immunogenicità. Vari studi dimostrano che graft decellularizzati possono presentare una ridotta immunogenicità, tuttavia c’è la necessità di individuare un protocollo efficace che preservi le caratteristiche morfo-strutturali e meccaniche del tessuto . Inoltre, sembra che anche le tecniche di criopreservazione possano diminuire l'immunogenicità dei tessuti ma le evidenze al riguardo sono ancora scarse. Pertanto, questo progetto di tesi, si è focalizzato sullo sviluppo di graft tracheali umani decellularizzati (in collaborazione con FBTV - Fondazione Banca dei Tessuti del Veneto) e sulla combinazione del trattamento di decellularizzazione con la criopresrvazione, per valutare l'impatto di entrambe le strategie sulle caratteristiche del tessuto tracheale. I campioni sono stati valutati per l’aspetto macroscopico, e per la presenza di nuclei/DNA residuo (DAPI, analisi quantitativa del DNA). L’organizzazione del tessuto e la matrice extracellulare sono state altresì investigate mediante colorazioni istologiche specifiche (ematossilina-eosina, Tricromica di Masson, Sirius Red, Van Gieson, Alcian Blue). Il contenuto di glicosamminoglicani è stato quantificato attraverso saggio biochimico specifico.. Per una valutazione delle proprietà ultrastrutturali e meccaniche, sono stati condotti studi di Microscopia Elettronica a Scansione e prove di compressione. I risultati dello studio hanno dimostrato l'efficacia del protocollo di decellularizzazione (DNA ˂50 ng/mg di tessuto; preservazione delle proteine ECM e delle proprietà meccaniche) e il positivo impatto della criopreservazione nella conservazione del tessuto senza comprometterne le caratteristiche strutturali e meccaniche. Il protocollo di decellularizzazione sviluppato da FBTV, unitamente alla criopreservazione, potrebbe portare a sostituti tracheali promettenti con un futuro impiego nella pratica clinica