Insight on CRISPR-Cas9 genome editing technology: optimization and application in a nematode model

CRISPR-Cas9 genome editing technology has revolutionized the field of genetic manipulation. This thesis focuses on optimizing and applying CRISPR-Cas9 in Caenorhabditis elegans in order to reproduce a specific human gene variant object of this study. Key parameters such as guide RNA design and preparation of CRISPR-Cas9 mix were refined to enhance editing efficiency and specificity. The optimized protocol enabled not only to obtain precise genetic modifications in the worm genome, but also resulted in higher editing efficiency. Off-targets effects were minimized by carefully choosing guide RNA and by analyzing two independent worm lines carrying the same gene editing. This work underscores the potential of CRISPR-Cas9 in genetic engineering, highlighting its significance for biomedical research and therapeutic applications through reliable genome editing.

Il sistema di editing genomico CRISPR-Cas9 ha rivoluzionato il campo della manipolazione genetica. Questa tesi si concentra sull'ottimizzazione e l'applicazione di CRISPR-Cas9 in Caenorhabditis elegans al fine di riprodurre una specifica variante genica umana oggetto di questo studio. Abbiamo perfezionato elementi cruciali come il design dell'RNA guida e la preparazione della mix CRISPR-Cas9 per migliorare l'efficienza e la specificità dell'editing. Il protocollo ottimizzato ha permesso non solo di ottenere modifiche genetiche precise nel genoma del verme, ma ha anche portato a una maggiore efficienza nell’editing. Gli effetti aspecifici sono stati minimizzati scegliendo attentamente l’RNA guida ed analizzando due linee indipendenti di nematodi aventi le stesse modificazioni nel gene di interesse. Questo lavoro sottolinea il potenziale di CRISPR-Cas9 nell'ingegneria genetica, evidenziando la sua importanza per la ricerca biomedica e le applicazioni terapeutiche attraverso un editing genomico preciso e affidabile.