Optimization of live imaging approaches for studying neural development

Bioimaging relates to methods used to visualize cellular processes, tissues and living organisms. In the past decade, technological advances in microscopy have enabled inspection of biological samples from mm to nm scale with high resolution. As a result, the volume of collected data has significantly increased, and processes of correct interpretation and analysis have requested highly specialized methods in mathematics and computational physics. My thesis aims to optimize image acquisition and analysis of neuronal tissue in both fixed samples (cortical brain organoids) and living embryos. To achieve this, we follow two approaches. We create pipelines for cortical brain organoids image processing based on standard image analysis software and optimize environmental conditions and cell detection for time-lapse microscopy of living embryos. To analyze cortical brain organoids images, we started from single pixel analysis using Fiji, an image analysis software, to identify and quantify synapses based on fluorescent markers. The organoids were derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from either healthy donors or Fragile-X Syndrome (FXS) patients. To reduce artifacts inside the single image and artifacts between different images of the acquired images, we optimized three imaging processing pipelines. This allows a comparison between the two phenotypes, showing that in FXS patients the number of synapses decrease. We then moved from fixed samples to the visualization of dynamic biological processes. Specifically, we performed time-lapse imaging of the neural tube, the embryonic precursor of the central nervous system. Chicken embryos are our preferred experimental model as they are easy to manipulate, and they form their neural tube similarly to human embryos. Long-term microscopy experiments of biological samples require the maintenance of precise environmental parameters of CO2 and temperature. To keep the embryos alive on the microscope stage, we optimized a cage incubator system, to maintain the temperature steady at 37 °C. After the correct hardware configuration was established, we acquired images at regular intervals (10-30 min) and aimed to analyze tissue flow inside the neural tube. For this objective, we have optimized parameters of a Matlab toolbox (PIV lab) originally used for fluid mechanics engineering. We first analyzed the tissue flow based on brightfield images and in two experimental conditions, in controls and in embryos in which the neural tube closure was obstructed. Then the signal detection was improved by introducing a nuclear fluorescent marker. On the whole, my thesis aims to highlight the importance of image processing and analysis by automated computational methods selected ad hoc for the biological processes under investigation.

Il settore delle bioimmagini utilizza metodi per visualizzare processi cellulari, tessuti ed organismi viventi. Nel decennio precedente, il progresso tecnologico nel campo della microscopia ha permesso lo studio di campioni biologici dalla scala dei mm ai nm, mantenendo un’alta risoluzione. Di conseguenza, il volume dei dati è cresciuto in modo significativo ed i processi di corretta interpretazione ed analisi hanno richiesto expertise in matematica e fisica computazionale. La mia tesi si propone di ottimizzare l’analisi delle immagini di tessuto neurale sia in campioni fissati (organoidi cerebrali corticali) che embrioni vivi. Per raggiungere questi obiettivi, abbiamo seguito due approcci. Abbiamo creato linee guida per il processamento delle immagini di organoidi cerebrali corticali basate su un software standard di analisi delle immagini ed abbiamo ottimizzato le condizioni ambientali ed il riconoscimento cellulare durante la microscopia time-lapse di embrioni vivi. Per analizzare le immagini di organoidi cerebrali corticali, siamo partiti dall’analisi dei singoli pixel usando Fiji, un software di analisi di immagini, ed abbiamo identificato e quantificato le sinapsi individuate da marcatori fluorescenti. Gli organoidi sono stati derivati da cellule umane staminali indotte pluripotenti (hiPSCs), sia da donatori sani che da pazienti affetti dalla sindrome dell’X fragile (FXS). Per ridurre gli artefatti, sia all’interno della singola immagine, che tra immagini diverse, abbiamo ottimizzato tre linee guida di analisi di immagine. Questo ha permesso un confronto tra i due fenotipi, evidenziando che nei pazienti affetti da FXS il numero di sinapsi decresce. Dallo studio di campioni fissati, siamo passati alla visualizzazione di campioni vivi e processi biologici dinamici. Nello specifico abbiamo realizzato l’acquisizione di immagini time-lapse del tubo neurale, il precursore embrionale del sistema nervoso centrale. Gli embrioni di pollo sono il nostro modello sperimentale prescelto dato che sono facili da manipolare, ed il loro sviluppo del tubo neurale è simile a quello degli embrioni umani. Gli esperimenti di microscopia a lungo termine di campioni biologici richiedono il mantenimento di precisi parametri ambientali, quali la CO2 e la temperatura. Per mantenere gli embrioni vivi sulla piattaforma del microscopio, abbiamo ottimizzato un sistema di incubazione a gabbia, per mantenere la temperatura stabile a 37 °C. Dopo aver stabilito la corretta configurazione dell’hardware, abbiamo acquisito le immagini ad intervalli regolari (10 – 30 min) ed abbiamo analizzato il flusso tissutale all’interno del tubo neurale. Per questo obbiettivo, abbiamo ottimizzato i parametri di un toolbox di Matlab (PIV lab) usato originariamente nell’ambito della meccanica dei fluidi. Abbiamo prima analizzato il flusso tissutale su immagini a campo chiaro in due condizioni sperimentali, nei controlli e negli embrioni in cui la chiusura del tubo neurale era ostruita. In seguito, il rilevamento del segnale è stato migliorato utilizzando un marcatore nucleare fluorescente. In conclusione, la mia tesi propone di evidenziare l’importanza del processamento ed analisi delle immagini utilizzando metodi computazionali automatizzati scelti ad hoc per i processi biologici d’interesse.