Development of Engineered Lipid Nanoparticles with Enhanced Endosomal Escape for Targeted miRNA Delivery in Large Granular Lymphocyte Leukemia

Large Granular Lymphocyte Leukemia (L-LGLL) involves the uncontrolled expansion of STAT3-mutated T-LGLs, which downregulate miR-146b. This project aims to restore miR-146b levels in T-LGLs by delivering therapeutic miR-146b via lipid nanoparticles (LNPs). A library of LNPs with increasing PEG density was developed to optimize oligonucleotide condensation, blood circulation, and endosomal escape. The LNPs were formulated using a 50:30:16:4 mol% mixture of SM-102, Chol, HSPC, and OCE, with DSPE-Hz-mPEG2kDa added (0-5 mol%) for pH-responsive release in the endosome. LNPs produced via pre-insertion PEGylation had a mean size of 120 nm, while post-insertion PEGylation increased size to 170 nm at 5 mol% PEG. The zeta potential decreased from +40 mV to +10 mV with increasing PEG. Loading efficiency remained over 80% across all formulations, confirming OCE’s condensing ability. The LNPs showed good stability at 4°C but limited stability with DMG-mPEG2kDa in serum at 37°C. Hemolysis assays confirmed the biocompatibility of DSPE-Hz-mPEG-coated LNPs, with over 80% cell viability after 4 hours. LNPs with DMG-mPEG exhibited greater cellular uptake, but this non-specific uptake may lead to toxicity. At pH 5, DSPE-Hz-mPEG LNPs had superior endosomal escape, achieving complete gene silencing at 25 nM and 100 nM siRNA for 3 and 5 mol% PEG coatings, respectively. Three monoclonal antibodies (TB01, HNK-1, QA17A04) were tested for their selectivity toward CD57, a receptor overexpressed in STAT3-mutated cells. TB01 and QA17A04 induced receptor-mediated endocytosis (27.5% and 27.7% internalization), while HNK-1 showed minimal internalization (3.4%). These findings support the use of DSPE-Hz-mPEG LNPs for targeted miRNA delivery in L-LGLL.

La leucemia a grandi linfociti granulari (L-LGLL) è caratterizzata dall'espansione incontrollata di linfociti T-LGL con mutazione STAT3, che riduce l'espressione di miR-146b. Questo progetto mira a ripristinare i livelli di miR-146b nei T-LGL utilizzando nanoparticelle lipidiche (LNPs) per veicolare il miRNA terapeutico. Una libreria di LNPs con densità crescente di polietilenglicole (PEG) è stata sviluppata e testata per ottimizzare la capacità di condensazione e caricamento del miRNA, garantendo circolazione prolungata e rilascio endosomiale efficiente. Le LNPs sono state generate con SM-102/Colesterolo/HSPC/OCE (50:30:16:4 mol%) e miRNA marcato con Cianina-5 (N/P 10). OCE, sintetizzato dal nostro gruppo, è stato incluso per condensare il miRNA e facilitare l'assorbimento cellulare, mentre SM-102 funge da lipide fusogenico per il rilascio endosomiale. Il DSPE-Hz-mPEG2kDa è stato utilizzato come rivestimento "stealth", grazie alla sua capacità di distacco in ambiente acido endosomiale, favorendo il rilascio del carico nel citosol. Sono stati usati come controlli DMG-PEG e DSPE-PEG, non sensibili al pH. Le LNPs PEGilate tramite pre-inserzione hanno mantenuto dimensioni di circa 120 nm, mentre quelle PEGilate tramite post-inserzione hanno mostrato un aumento fino a 170 nm con il 5 mol% di PEG. Il potenziale zeta delle LNPs è passato da +40 mV a +10 mV con l'aumento del PEG. Il caricamento delle LNPs è stato superiore all'80% e la stabilità a 4°C è risultata ottimale, ma in presenza di proteine seriche a 37°C, le LNPs con DMG-mPEG hanno mostrato scarsa stabilità. Studi di emolisi a pH 7.4 e citotossicità hanno confermato la biocompatibilità delle LNPs PEGilate con DSPE-Hz-mPEG e DSPE-mPEG, mentre le LNPs con DMG-mPEG hanno mostrato maggiore associazione cellulare, suggerendo un aumento dell'assorbimento non specifico e possibili effetti tossici. Gli studi di rilascio endosomiale a pH 5 hanno dimostrato che le LNPs con DSPE-Hz-mPEG hanno una maggiore capacità di interazione con la membrana rispetto ai controlli non sensibili al pH. Per il targeting attivo, tre anticorpi monoclonali (mAb) sono stati selezionati per la loro specificità verso il recettore CD57, espresso nelle cellule con mutazione STAT3. Solo i cloni TB01 e QA17A04 hanno indotto endocitosi mediata, con circa il 27% di internalizzazione, mentre HNK-1 ha mostrato un tasso molto inferiore (3.4%). Questi risultati dimostrano l'efficacia del rilascio mirato del miRNA terapeutico grazie al distacco selettivo del DSPE-Hz-mPEG in ambiente acido endosomiale, suggerendo l'uso di LNPs PEGilate per il trattamento di patologie come la L-LGLL.