Investigation of mRNA localization in different neuronal compartments and its impact in synaptopathies

Many neurodevelopmental and neurodegenerative disorders are associated with dysfunctions in the transport and processing of RNA granules and synaptic vesicles at synapses. Failures in the regulative mechanisms for local translation of mRNAs at synapses, affect the physiological synaptic proteins’ network, consequently disrupting the synaptic plasticity and transmission’s functionalities. Although many approaches have been carried out to characterize the synaptic transcriptome, splicing regulation, and its isoform complexity, some synapse‑specific transcriptome information are still missing. To fill this knowledge gap, long-read Nanopore RNA-seq was carried out on the total homogenate (H) and in the crude synaptic fraction (P2) of Shank3(+/+) and Shank3Δ11(-/-) mice primary cortical (CTX) neurons. SHANK3 is a master scaffolding postsynaptic density protein and mutations in its gene are associated with Autism Spectrum Disorder (ASD)-like diseases, like Phelan-McDermid Syndrome (PMDS). By combining exome analysis and SynGO-based screening approach and after selecting according to certain characteristics, we ended with the three candidate genes Hnrnpu, Rbmx, and Sfpq with upregulated coding exons in the Shank3(+/+) P2, as well as in the Shank3Δ11(-/-) P2 fractions. The expression and localization of these exons of interest have been validated through RT-qPCR and in situ hybridization (ISH) on mouse primary cortical (CTX) and hippocampal (HP) neurons, to check their brain region- and synapse-type-specificity. Differences between the expression and localization of these exons of interest at the RNA level in HP and CTX neurons have been detected. For investigation of pathway-specific synaptic transcriptome changes upon stimuli, a mGluR agonist has been used. DHPG acute treatment does not majorly influence the expression and localization of these genes’ exons of interest within HP and CTX neuronal bodies. For a broader perspective and synaptopathies’ pathomechanisms’ insights, the expression of these exons of interest has been visualized and compared through ISH on brain tissue slices from both Shank3(+/+) and Shank3Δ11(-/-) adult mice, indicating differences. Finally, this study highlights promising candidate transcripts and exons, and respective RNA-binding protein domains, that may be functionally relevant in excitatory synapses’ physiology and highlight the importance of long-read sequencing techniques for investigations on transcript and exon level to unravel entirety of the synaptic transcriptome.

Molti disturbi del neurosviluppo e neurodegenerativi sono associati a disfunzioni nel trasporto e nel processamento dei granuli di RNA e delle vescicole sinaptiche a livello delle sinapsi. Le disfunzioni nei meccanismi di regolazione della "traduzione locale" degli mRNA nelle sinapsi influenzano il network fisiologico delle proteine sinaptiche, interrompendo così la plasticità e trasmissione sinaptica. Per colmare questa lacuna di conoscenza, è stato effettuato un Nanopore RNA Sequencing sull'omogenato totale (H) e nella frazione sinaptica grezza (P2) di neuroni corticali (CTX) primari di topi Shank3(+/+) e Shank3Δ11(-/-). SHANK3 è una delle principali proteine scaffolding della densità postsinaptica e le mutazioni nel suo gene sono associate a malattie del disturbo dello spettro autistico (ASD), come la sindrome di Phelan-McDermid (PMDS). Combinando l'analisi degli esoni e l'approccio di screening basato sul database "SynGO", e dopo aver selezionato in base a determinate caratteristiche, abbiamo ottenuto i tre geni candidati Hnrnpu, Rbmx e Sfpq con esoni codificanti upregolati nelle frazioni Shank3(+/+) P2 e Shank3Δ11(-/-) P2. L'espressione e la localizzazione di questi esoni di interesse sono state validate mediante RT-qPCR e ibridazione in situ (ISH) su neuroni primari corticali e ippocampali di topo, per verificare la loro specificità per regione cerebrale e per tipo di sinapsi. Sono state rilevate differenze tra l'espressione e la localizzazione di questi esoni di interesse a livello di RNA nei neuroni ippocampali e corticali. Per studiare i cambiamenti del trascrittoma sinaptico, specifici per un determinato pathway, in seguito a stimulazione, è stato utilizzato un agonista dei recettori metabotropici per il glutammato. Il trattamento acuto con DHPG non influenza in modo significativo l'espressione e la localizzazione degli esoni di questi geni di interesse nei corpi dei neuroni ippocampali e corticali. Per una prospettiva più ampia e per approfondire i meccanismi patologici delle sinaptopatie, l'espressione di questi esoni di interesse è stata visualizzata e confrontata mediante ISH su fette di tessuto cerebrale di topi adulti Shank3(+/+) e Shank3Δ11(-/-), evidenziando differenze. Infine, questo studio evidenzia promettenti trascritti ed esoni, e rispettivi domini proteici leganti l'RNA, che potrebbero essere funzionalmente rilevanti nella fisiologia delle sinapsi eccitatorie e sottolinea l'importanza delle tecniche di sequenziamento long-read per le indagini a livello di trascritto ed esone per svelare l'interezza del trascrittoma sinaptico.