Application of HyperTRIBE to identify RNA Targets of ribonucleoproteins Hrp48 and Hrb87F in S2R+ cells

RNA-binding proteins (RBP) are characterized by the presence of one or more RNA-binding domains (RBD) through which they interact with single- or double-stranded RNA molecules, influencing their functions and fate. Therefore they are crucial for regulating gene expression at a post-transcriptional level, and alterations in their activity are linked to many diseases. This thesis focuses on two Drosophila melanogaster RBPs, Hrp48 and Hrb87F, both homologs of the human hnRNPA/B family. Hrp48 has important roles in splicing regulation, translation and mRNA localization while Hrb87F is involved in alternative splicing, telomere maintenance, omega speckles formation, development and response to stress. Recent evidence suggests that Hrb87F also plays a role in the regulation of circadian rhythms. To fully understand the function of a RBP, identifying its RNA targets is crucial. Many techniques can be used for this purpose, with “Cross-linking and immunoprecipitation” (CLIP) being the golden standard. While CLIP offers many advantages, it has a high rate of false positives and necessitates specific antibodies for the targeted RBP. This research aims to utilize an alternative technology, “Targets of RNA-binding proteins identified by editing” (TRIBE), to identify the RNA targets of Hrb87F and Hrp48 and, consequently, analyze the major processes in which these proteins are involved.

Le RNA-binding proteins (RBP) sono caratterizzate dalla presenza di uno o più siti di legame per l’RNA tramite i quali interagiscono con molecole a singolo o doppio filamento di RNA, influenzandone funzione e destino. Di conseguenza, risultando cruciali nella regolazione dell’espressione genica a livello post-trascrizionale, alterazioni nella loro attività sono legate a diverse patologie. Questa tesi si focalizza su due RBP di Drosophila melanogaster, Hrp48 e Hrb87F, entrambi omologhi della famiglia di proteine hnRNPA/B umana. Hrp48 ha un ruolo importante nella regolazione dello splicing, nella traduzione e localizzazione degli mRNA, mentre Hrb87F è coinvolta nello splicing alternativo, nel mantenimento dei telomeri, nella formazione degli omega speckles, nello sviluppo e nella risposta agli stress. Evidenze recenti suggeriscono che Hrb87F possa anche avere un ruolo della regolazione dei ritmi circadiani. Per comprendere appieno la funzione di una RBP, è fondamentale identificare i suoi RNA target. Diverse tecniche possono essere utilizzate a tale scopo: il “Cross-linking and immunoprecipitation (CLiP)” è considerata la tecnica standard di riferimento. Sebbene la CLiP offra numerosi vantaggi, è caratterizzata da un alto tasso di falsi positivi e richiede anticorpi specifici per la RBP di interesse. Questo studio si propone di utilizzare una tecnologia alternativa, chiamata "Targets of RNA-binding proteins identified by editing" (TRIBE), per identificare gli RNA target di Hrb87F e Hrp48 e, di conseguenza, analizzare i principali processi in cui queste proteine sono coinvolte.