Ottimizzazione di uno screening chimico per l’identificazione di induttori della via di detossificazione SCL14-dipendente in Arabidopsis thaliana

Approcci di screening obiettivi sono strumenti potenti che permettono di identificare nuovi elementi nei processi biologici. Il termine “screening genetico chimico” si riferisce alla tecnica che prevede l'utilizzo della risposta di un reporter, come l'espressione della luciferasi sotto il controllo di un promotore di interesse, per scoprire nuove molecole che influenzano un determinato processo quando applicate alle piante. Tali molecole permettono l’identificazione di regolatori che altrimenti non potrebbero essere identificati tramite screening di forward genetic, a causa della ridondanza della famiglia genica o della letalità dei mutanti. Questa tesi si concentra sull'ottimizzazione di un protocollo di screening di una libreria di sostanze chimiche per scoprire nuovi induttori del pathway di detossificazione SCL14-dipendente in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). Il lavoro si basa sull’uso della linea reporter pAER:LUC, che esprime il gene della luciferasi sotto il controllo del promotore dell'alchenal reduttasi (AER). AER è un enzima a valle del pathway mediato da SCL14 e partecipa alla prima fase del processo di detossificazione degli xenobiotici. Per la configurazione dello screening, sono state condotte diverse prove, tra cui la crescita delle piante di Arabidopsis pAER:LUC in piastre da 96 pozzetti e la misurazione della luminescenza in seguito a trattamento con salicilato. Tuttavia, il salicilato si è rivelato in grado di reprimere il pathway anziché attivarlo. Inoltre, nelle fasi iniziali, è stato osservato un segnale di luminescenza eterogeneo, probabilmente dovuto all'instabilità del costrutto all'interno del genoma della pianta. Per affrontare queste problematiche, sono stati selezionati semi positivi in grado di generare un buon segnale di luminescenza utilizzando il β-ciclocitrale, noto induttore del pathway, come trattamento. Tuttavia, i semi selezionati non hanno mostrato performance ottimali. Sono stati quindi testati nuovi batch di semi, al fine di identificare le migliori linee da utilizzare nello screening della libreria chemicals. I semi selezionati sono stati utilizzati per iniziare uno screening qualitativo della libreria, verificando l’induzione o meno del pathway. Per due sostanze chimiche risultate positive allo screening è stato fatto un ulteriore verifica analizzando mediante Real-time PCR l'induzione di geni coinvolti nel pathway di detossificazione: AER, ANAC102, CAT2 e ADH1. I risultati hanno mostrato che solo la terbutrina induce un’espressione significativa nei geni analizzati. In particolare ANAC102 e CAT2 risultano particolarmente indotti dopo 4 ore di trattamento, seguito da una diminuzione dell’espressione dopo 24 ore. Questi risultati suggeriscono che la terbutrina potrebbe rappresentare un potenziale induttore del pathway di detossificazione SCL14-dipendente. Nonostante NCT-506 sia risultato positivo allo screening, l’analisi di Real-time PCR ha evidenziato che il composto non è in grado di indurre l’espressione dei geni analizzati. Questi risultati suggeriscono che il metodo di screening necessita di ulteriori step di ottimizzazioni. Questa fase di screening è da considerarsi qualitativa e sarà seguita da una seconda fase in cui verranno rianalizzati solo i composti positivi identificati, con l'obiettivo di confermare la loro attività. La validazione dei risultati potrà essere effettuata tramite Real-time PCR, per garantire che i composti selezionati inducano effettivamente l'espressione dei geni implicati nel pathway in esame. In conclusione, il lavoro svolto ha permesso di gettare le basi per la configurazione di un sistema di screening chimico high-throughput. I risultati ottenuti permetteranno di ottenere una maggiore comprensione dei meccanismi di detossificazione degli xenobiotici nelle piante, con l’obbiettivo di scoprire nuove tecnologie per rendere le piante più tolleranti a stress ambientali.