Costruzione di vettori integrativi per l'ingegnerizzazione metabolica di Synechocystis sp. PCC6803

This project focuses on the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Cyanobacteria are a group of prokaryotic photoautotrophic microrganisms that utilize photosynthesis to synthesize essential molecules for their growth, using carbon dioxide (as a carbon source) and sunlight (as an energy source). Synechocystis has been a model organism for studying photosynthesis and is now targeted in biocatalysis projects aimed at developing low-cost, environmentally friendly green factories. However, the limited availability of specific molecular tools makes the evolution and optimization of these processes challenging. Therefore, in this thesis project, two new chromosomal integration vectors for manipulating Synechocystis sp. PCC6803 were designed and constructed to at least partially address this limitation. These two new vectors, named pN8Psll1626_UniversalVector and pN15Ptrc1O_UniversalVector, allow site-specific insertion of an expression cassette and a resistance cassette in two different regions of the Synechocystis sp. PCC6803 genome known to be neutral sites. pN8Psll1626_UniversalVector is a plasmid where, for constructing the expression cassette, native genetic elements (promoter, RBS or ribosome binding site, and terminator) originally present in the Synechocystis genome were used. The plasmid includes two fragments of the slr0573 locus that allow the insertion of the entire expression cassette, along with a chloramphenicol resistance cassette, at this locus through homologous recombination. For the construction of the pN15Ptrc1O_UniversalVector plasmid, it was decided to use some elements derived from E. coli, already widely used in commercial expression plasmids: the Ptrc1O promoter and the rrnB gene terminator. This is noteworthy as, in general, many bio-bricks derived from E. coli do not function in Synechocystis. However, this vector does include some native Synechocystis elements, specifically the ndhJ RBS and the two sequences flanking this construct, which guide the insertion into the slr0271 locus.

Questo progetto si focalizza sul cianobatterio Synechocystis sp. PCC6803. I cianobatteri sono un gruppo di microrganismi procariotici fotoautotrofi, in grado di sfruttare la fotosintesi per sintetizzare le molecole essenziali per la loro crescita, a partire dall’anidride carbonica (come fonte di carbonio) e luce solare (come fonte di energia). Synechocystis, in particolare, è stato un organismo modello per lo studio della fotosintesi; è oggi target di progetti di biocatalisi che mirano a sviluppare fabbriche verdi a basso costo e basso impatto ambientale. Tuttavia, la scarsa disponibilità di strumenti molecolari specifici rende difficoltosa l’evoluzione ed ottimizzazione dei processi. Nel corso di questo progetto di tesi sono quindi stati progettati e costruiti due nuovi vettori di integrazione cromosomiale per la manipolazione di Synechocystis sp. PCC6803, al fine di superare almeno parzialmente tale limite. Questi due nuovi vettori, che prendono il nome di pN8Psll1626_UniversalVector e pN15Ptrc1O_UniversalVector, permettono l’inserzione sito specifica di una cassetta di espressione e di una cassetta di resistenza in due differenti regioni del genoma di Synechocystis sp. PCC6803 note per essere siti neutrali. pN8Psll1626_UniversalVector è un plasmide nel quale, per la costruzione della cassetta d’espressione, sono stati sfruttati elementi genetici (promotore, RBS o ribosome binding site e terminatore) nativi, ovvero originari nel genoma di Synechocystis. Il plasmide si completa con i due frammenti locus genico slr0573 che permettono l’inserimento in tale locus dell’intera cassetta d’espressione, insieme a quella per la resistenza all’antibiotico cloramfenicolo, mediante il meccanismo della ricombinazione omologa. Per la costruzione del plasmide pN15Ptrc1O_UniversalVector si è deciso di utilizzare alcuni elementi derivanti da E. coli, già largamente impiegati in plasmidi d’espressione commerciali: il promotore Ptrc1O e il terminatore del gene rrnB. È questo un punto degno di nota dato che, in generale, molti bio-bricks derivanti da E.coli non funzionano in Synechocystis. Questo vettore presenta comunque degli elementi nativi di Synechocystis, che sono il RBS ndhJ e le due sequenze fiancheggianti questo costrutto, che guidano l’inserimento al locus slr0271.