Non-invasive imaging computational analysis for quantitative assessment of muscle contraction in human neuromuscular organoids.

The use of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), combined with various culturing methods, has made it possible to create human and eventually patient-specific in vitro models of tissues and organs. In particular, recent advances in bioengineering have enabled the development of organoids, three-dimensional (3D) self-organizing culture systems, typically derived from stem cells, that mimic the main and complex functional, structural and biological characteristics of an organ. Human neuromuscular organoids (NMO) derived from hiPSCs are capable of mimic the human neuromuscular system, which includes skeletal muscle in connection with neurons at the neuromuscular junction (NMJ). NMOs have been used as in vitro models to study the physiology or the pathological phenotypes of the neuromuscular system. Despite skeletal muscle contraction represents an important functional redout to evaluate NMO (dys)functionality, the tools available for quantify NMO contraction are still limited. Here we aim to identify computational strategies that allows reproducible quantification of muscle contraction of healthy or pathologic NMOs. In particular, in the lab where I performed the thesis, NMOs are used to model and study multiple pathologic condition of the neuromuscular system, such as Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and cancer-induced muscle cachexia. With the aim to reveal functional phenotypes in pathologic NMOs, when compared to healthy NMOs, I integrated different software to analyze live imaging datasets and measure muscle contraction of NMOs. In particular, I integrated and studied the applicability of an open-source tool with a graphical interface for particle image velocimetry (PIV) analysis in MATLAB (PIVlab), to derive specific parameters such as displacement of muscle contraction. Our results show that PIVlab software allow to better quantify the NMOs contraction, allowing the identification of functional phenotypes in diseased NMOs. Moreover, such analysis also clearly demonstrate the intrinsic variability of NMO activity and the requirement of a relevant number of NMO for the identification of functional phenotypes. Despite further amelioration needs to be integrated with this software, we concluded that PIVlab analysis can be of key relevance to define skeletal muscle contraction phenotypes in NMO in vitro models of human neuromuscular diseases.

L'uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), combinato con vari metodi di coltura, ha reso possibile la creazione di modelli in vitro di tessuti e organi umani e, infine, specifici per paziente. In particolare, i recenti progressi nella bioingegneria hanno consentito lo sviluppo di organoidi, sistemi di coltura auto-organizzanti tridimensionali (3D), tipicamente derivati da cellule staminali, che imitano le principali e complesse caratteristiche funzionali, strutturali e biologiche di un organo. Gli organoidi neuromuscolari umani (NMO) derivati da hiPSC sono in grado di imitare il sistema neuromuscolare umano, che include il muscolo scheletrico in connessione con i neuroni nella giunzione neuromuscolare (NMJ). Gli NMO sono stati utilizzati come modelli in vitro per studiare la fisiologia o i fenotipi patologici del sistema neuromuscolare. Nonostante la contrazione del muscolo scheletrico rappresenti un'importante ridondanza funzionale per valutare la (dis)funzionalità degli NMO, gli strumenti disponibili per quantificare la contrazione degli NMO sono ancora limitati. Qui miriamo a identificare strategie computazionali che consentano una quantificazione riproducibile della contrazione muscolare di NMO sani o patologici. In particolare, nel laboratorio in cui ho svolto la tesi, gli NMO vengono utilizzati per modellare e studiare molteplici condizioni patologiche del sistema neuromuscolare, come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la cachessia muscolare indotta dal cancro. Con l'obiettivo di rivelare fenotipi funzionali negli NMO patologici, rispetto agli NMO sani, ho integrato diversi software per analizzare set di dati di imaging in tempo reale e misurare la contrazione muscolare degli NMO. In particolare, ho integrato e studiato l'applicabilità di uno strumento open source con un'interfaccia grafica per l'analisi della velocimetria delle immagini di particelle (PIV) in MATLAB (PIVlab), per derivare parametri specifici come lo spostamento della contrazione muscolare. I nostri risultati mostrano che il software PIVlab consente di quantificare meglio la contrazione degli NMO, consentendo l'identificazione di fenotipi funzionali negli NMO malati. Inoltre, tale analisi dimostra chiaramente anche la variabilità intrinseca dell'attività NMO e la necessità di un numero rilevante di NMO per l'identificazione di fenotipi funzionali. Nonostante ulteriori miglioramenti debbano essere integrati con questo software, abbiamo concluso che l'analisi PIVlab può essere di fondamentale importanza per definire i fenotipi di contrazione del muscolo scheletrico nei modelli NMO in vitro di malattie neuromuscolari umane.