Effect of Lipid Composition on the Biopharmaceutical Properties of Peptide-Loaded LNPs for Oral Delivery

La somministrazione orale di farmaci biologici rappresenta una sfida significativa, richiedendo strategie per proteggere le biomolecole dalle condizioni avverse del tratto gastrointestinale (GIT). Le nanoparticelle lipidiche (LNPs) emergono come piattaforme promettenti per l'incapsulamento e la somministrazione di biomolecole attraverso il GIT. Questo studio si è concentrato sullo sviluppo di LNP caricate con l’analogo del glucagon-like peptide-1 (GLP-1), exenatide, utilizzando un approccio microfluidico per migliorarne la biodisponibilità orale. La fase organica per la preparazione delle LNP include una miscela lipidica di EPC o DOPC (fosfolipidi con basse temperature di transizione di fase) combinata con colesterolo (Chol) in un rapporto molare di 1:3. La fase acquosa è costituita da un tampone HEPES a pH 8, in cui l'exenatide è pre-complessato con il lipide cationico DOTAP in un rapporto molare di 1:12 secondo l'interazione di accoppiamento ionico idrofobico (HIP). Il rapporto di carico del peptide è stato mantenuto al 10% (w/w) rispetto alla massa lipidica totale, migliorando l'efficienza di incapsulamento. Le LNP caricate con exenatide sono state caratterizzate mediante diffusione dinamica della luce (DLS), rivelando dimensioni delle particelle di circa 90 nm, con un indice di polidispersività (PDI) inferiore a 0,2 e un potenziale zeta positivo di circa 50 mV. Le efficienze di incapsulamento (EE) erano circa il 90% e la capacità di carico (LC) circa il 9%, determinate tramite RP-HPLC. La superficie degli LNP è stata rivestita con PEG per migliorarne la diffusione attraverso lo strato mucoso e facilitare l’assorbimento attraverso la barriera intestinale, utilizzando mPEG2kDa-DSPE in due gradi di PEGilazione (10% e 30% w/w rispetto al peso degli LNP). La PEGilazione ha ridotto significativamente il potenziale zeta da 50 mV a circa 25 mV per la formulazione al 10% di PEG e a 10 mV per quella al 30%, migliorando la stabilità delle nanoparticelle. Gli studi di rilascio, condotti per 2 ore in fluido gastrico simulato (SGF) e 94 ore in fluido intestinale simulato (SIF), hanno mostrato un rilascio prolungato per oltre 96 ore nelle LNP PEGilate, rispetto al rilascio completo del peptide entro 72 ore nelle LNP non PEGilate. La stabilità enzimatica degli LNP è stata testata in SGF contenente pepsina e in SIF con tripsina per simulare le condizioni enzimatiche del GIT. Gli LNP PEGilati hanno protetto efficacemente l’exenatide dalla degradazione enzimatica, mantenendo circa il 60% del peptide dopo l’incubazione, rispetto al 40% nelle formulazioni non PEGilate. I test di biocompatibilità, condotti tramite saggi MTT, hanno confermato la biocompatibilità degli LNP con le cellule intestinali Caco-2. Studi sull'associazione cellulare e il trasporto degli LNP, effettuati su questa linea cellulare coltivata a confluenza per mimare la barriera epiteliale intestinale, hanno mostrato un aumento dose-dipendente dell’associazione degli LNP con le cellule Caco-2. Tuttavia, la PEGilazione ha ridotto l'associazione cellulare e la permeazione attraverso il monostrato cellulare, con l’aumento della densità di PEG sulla superficie delle particelle. Gli studi di farmacocinetica in vivo, condotti su ratti Sprague-Dawley, hanno mostrato che la somministrazione orale di LNP caricati con exenatide ha migliorato significativamente la biodisponibilità dell'exenatide rispetto al peptide non formulato. La biodisponibilità relativa è risultata pari al 4,3% per gli LNP non PEGilati e al 5,3% per gli LNP PEGilati con il 10% di PEG, rispetto alla somministrazione sottocutanea, utilizzata come riferimento.

The oral delivery of biological drugs represents a significant pharmaceutical challenge, requiring strategies to protect biomolecules from the harsh conditions of the gastrointestinal tract (GIT). Lipid nanoparticles (LNPs) are emerging as a promising platform for encapsulating and delivering biomolecules through the GIT. This study focused on developing LNPs loaded with the glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog exenatide using a microfluidic approach to improve its oral bioavailability. The organic phase used for LNP preparation included a lipid mixture of EPC or DOPC (phospholipids with low phase transition temperatures) combined with cholesterol (Chol) at a 1:3 molar ratio. The aqueous phase consisted of HEPES buffer at pH 8 where exenatide was pre-complexed with the cationic lipid DOTAP in a 1:12 molar ratio according to the hydrophobic ion-pairing (HIP) interaction. The peptide feed ratio was maintained at 10% (w/w) relative to the total lipid mass. The exenatide/DOTAP associate was efficiently incorporated into the lipid matrix, enhancing encapsulation efficiency. Characterization of the two exenatide loaded LNPs using dynamic light scattering (DLS) revealed similar particle sizes of about 90 nm, polydispersity indices (PDI) below 0.2, and a positive zeta potential of approximately 50 mV. Encapsulation efficiencies (EE) of about 90% and loading capacities (LC) of about 9% were determined by RP-HPLC. The surface of the LNPs was coated with PEG to improve their diffusion through the mucus layer and facilitate absorption across the intestinal barrier. This was achieved by post-production incubation of the exenatide loaded LNP with the amphiphilic derivative mPEG2kDa-DSPE. Two PEGylation degrees, 10% and 30% (w/w) relative to the LNP weight, were tested. PEGylation significantly reduced the zeta potential from 50 mV to approximately 25 mV and 10 mV for the 10% and 30% PEG-coated formulations, respectively, while maintaining nanoparticle stability. Release studies performed for 2 hours in simulated gastric fluid (SGF) followed by 94 hours in simulated intestinal fluid (SIF) revealed that PEGylated LNPs achieved sustained release over 96 hours, whereas non-PEGylated LNPs completed peptide release within 72 hours. The enzymatic stability of LNPs was evaluated for 2 hours in simulated gastric fluid (SGF) containing pepsin and then in simulated intestinal fluid (SIF) with trypsin to mimic the enzymatic conditions of the GIT. PEGylated LNPs provided superior protection of exenatide against enzymatic degradation, retaining approximately 60% of the peptide after incubation, compared to 40% residual peptide for non-PEGylated formulations which were fairly overlapping with the residual non released peptide. MTT assays demonstrated that LNPs are biocompatible when incubated with the intestinal Caco-2 cells. The same cell line grown at confluence to mimic intestinal epithelial barrier was used to study cellular association and transport of the LNP. The results revealed a dose-dependent increase of the peptide loaded LNP association to Caco-2 cells, while PEG coating reduced the association to cells resulting in lower permeation of LNP across the cell monolayer as the PEG density increased on particle surface. In vivo pharmacokinetics were studied in Sprague-Dawley rats. The results demonstrated that oral administration of exenatide loaded LNPs significantly enhanced the bioavailability of exenatide compared to unformulated peptide. Subcutaneous administration was used to derive the relative bioavailability which resulted to be 4.3% for non-PEGylated LNPs and 5.3% for the 10 % PEGylated LNPs.