Dissezione molecolare e funzionale della proteina TMEM65: rilevanza per la comprensione delle encefalomiopatie mitocondriali

TMEM65 is a protein localized to the inner mitochondrial membrane, whose function is not yet fully understood. Mutations in TMEM65 lead to a clinical presentation of mitochondrial encephalopathy with a reduction in mitochondrial DNA (mtDNA) copy number, suggesting a role for TMEM65 in mtDNA maintenance. Preliminary studies in our laboratory have identified two TMEM65-containing complexes, which are absent in cells lacking mtDNA, supporting the hypothesis of the protein’s direct involvement in mtDNA stability. In this thesis, using genetic approaches based on TMEM65 depletion and overexpression, combined with confocal microscopy and RT-qPCR analyses, we demonstrate that TMEM65 ablation reduces the number of nucleoids and mtDNA, while its overexpression increases them. These findings are corroborated by acute mtDNA depletion experiments with ethidium bromide, showing a correlation between TMEM65 levels and mtDNA maintenance. Previous studies suggest that TMEM65 may regulate mitochondrial calcium homeostasis and that Tmem65-/- cells exhibit elevated Ca2+ levels. Therefore, we investigated whether calcium might act as a regulatory factor for mtDNA. Our preliminary experiments indicate that treatment with a calcium chelator increases TFAM expression, suggesting a potential recovery of mtDNA. The findings of this work provide a foundation for understanding the mechanisms through which TMEM65 and calcium regulate mtDNA maintenance.

TMEM65 è una proteina localizzata nella membrana interna mitocondriale, la cui funzione non è ancora completamente compresa. Mutazioni in TMEM65 causano un quadro clinico di encefalopatia mitocondriale con riduzione nel numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA), suggerendo un ruolo di TMEM65 nel mantenimento del mtDNA. Studi preliminari nel nostro laboratorio hanno identificato due complessi contenenti TMEM65, i quali risultano assenti in cellule prive di mtDNA, supportando l'ipotesi di un coinvolgimento diretto della proteina nella stabilità del mtDNA. In questa tesi, attraverso approcci genetici basati sulla deplezione e sovraespressione di TMEM65, combinati con analisi di microscopia confocale e RT-qPCR, si dimostra che l'ablazione di TMEM65 riduce il numero di nucleoidi e mtDNA, mentre la sovraespressione le aumenta. Questi risultati sono confermati attraverso esperimenti di deplezione acuta di mtDNA con bromuro di etidio, che hanno mostrato una correlazione tra i livelli di TMEM65 e mantenimento del mtDNA. Studi precedenti suggeriscono che TMEM65 possa regolare l'omeostasi del calcio mitocondriale, e che cellule Tmem65-/- hanno livelli alti di Ca2+, abbiamo quindi investigato se il calcio potesse agire come fattore regolatore del mtDNA. I nostri esperimenti preliminari indicano che il trattamento un chelante del calcio aumenta l'espressione di TFAM, suggerendo un possibile recupero del mtDNA. I risultati di questo lavoro rappresentano un punto di partenza per comprendere i meccanismi attraverso i quali TMEM65 e il calcio regolano il mantenimento del mtDNA.