EVALUATION OF STRAIN TYPES, HANDLING CONDITIONS AND ANALYTICAL VARIABILITIES TO BETTER UNDERSTAND AND PREDICT TITERS TO IMPROVE DOWNSTREAM PROCESS (DSP) PREDICTABILITY

Plasmids Deoxyribonucleic Acid (pDNA) are double stranded extrachromosomal molecules, which are introduced through molecular biology techniques. They have the capacity to replicate independently. Plasmid DNA can vary in terms of size, number of copies, capability to propagate in different bacteria and can enable new and different functions to the host strain. The increased relevance of biomedical applications of plasmid DNA (pDNA) to induce therapeutic effects has had a great impact on biopharmaceutical research and industry. pDNA manufacturing technologies are relatively new due to the increased C&GT (Cell and Gene Therapy) compared to protein manufacturing and therefore, improved understanding of pDNA manufacturing technologies is subsequently required. This study aims to better understand USP (Upstream processing) /DSP (Downstream processing) interfaces by evaluating E.coli strain types and handling conditions via flow cytometry and microscopy methods. Flow cytometry using a fluorescent DNA stain, Syto 9, was sufficiently capable of distinguishing plasmid and genomic DNA. Furthermore, current analytical methods for estimating pDNA titers exhibit a 30% variability, which affects experiments aiming to understand the factors needed to boost pDNA titers. Two methods were evaluated to address the high analytical method variability: Miniprep kits (silica – column) for pDNA isolation followed by A260nm quantification and the Qubit kit (fluorescence – based assay). Of the two evaluated methods, the Qubit High Sensitivity assay using extracts prepared from harvest broth (HB), without further manipulation, led to pDNA titer estimation with a reduced variability less than 10%. Although, the supercoiled isoform is the desired product isoform of the pDNA, due to its enhanced capability of penetrating the cell nucleus and enhancing gene expression in eukaryotic cells, it can exist as several species, for instance as open circular, linear or concatemers. The use of inline sensor, such as multi angle light scattering (MALS) presented a potential method for real-time monitoring of isoform separation and thereby making real-time decisions like, pooling of the right fractions of the desired isoform.

I plasmidi di acido desossiribonucleico (pDNA) sono molecole a doppio filamento extracromosomiche, che vengono introdotte tramite tecniche di biologia molecolare. Hanno la capacità di replicarsi autonomamente. Il DNA plasmidico può variare in termini di dimensioni, numero di copie, capacità di propagarsi in diversi batteri e può consentire nuove e diverse funzioni al ceppo ospite. La crescente rilevanza delle applicazioni biomediche del DNA plasmidico (pDNA) per indurre effetti terapeutici ha avuto un grande impatto sulla ricerca e sull'industria biofarmaceutica. Le tecnologie di produzione del pDNA sono relativamente nuove a causa dell'aumento della C&GT (Cell and Gene Therapy, Terapia Cellulare e Genica) rispetto alla produzione di proteine e, pertanto, è necessaria una comprensione migliorata delle tecnologie di produzione del pDNA. Questo studio mira a comprendere meglio le interfacce USP (Upstream Processing) / DSP (Downstream Processing) valutando i tipi di ceppi di E.coli e le condizioni di manipolazione tramite citometria a flusso e metodi di microscopia. La citometria a flusso, utilizzando una colorazione fluorescente per il DNA, Syto 9, è stata sufficientemente capace di distinguere il DNA plasmidico da quello genomico. Inoltre, i metodi analitici attuali per la stima dei titoli di pDNA mostrano una variabilità del 30%, il che influisce sugli esperimenti volti a comprendere i fattori necessari per aumentare i titoli di pDNA. Due metodi sono stati valutati per affrontare l'alta variabilità dei metodi analitici: kit Miniprep (silice – colonna) per l'isolamento del pDNA seguiti dalla quantificazione A260nm e il kit Qubit (saggio basato sulla fluorescenza). Dei due metodi valutati, il saggio ad alta sensibilità Qubit utilizzando estratti preparati dal brodo di raccolta (HB), senza ulteriori manipolazioni, ha portato a una stima del titolo di pDNA con una variabilità ridotta a meno del 10%. Sebbene l'isoforma superavvolta sia il prodotto desiderato del pDNA, grazie alla sua maggiore capacità di penetrare il nucleo cellulare e migliorare l'espressione genica nelle cellule eucariotiche, può esistere come diverse specie, ad esempio come forma circolare aperta, lineare o concatameri. L'uso di sensori in linea, come la diffusione della luce a multi angolo (MALS), ha presentato un metodo potenziale per il monitoraggio in tempo reale della separazione delle isoforme e quindi per prendere decisioni in tempo reale, come il raggruppamento delle frazioni corrette dell'isoforma desiderata.