Ku70 and DNA G-Quadruplexes: Investigating Their Interaction in Liposarcoma Cells

Uno studio condotto dal laboratorio della Prof.ssa Richter ha evidenziato come la regione promotoriale di CDK4, il secondo gene maggiormente amplificato nel liposarcoma ben differenziato (WDLPS), sia arricchita in G-quadruplex (G4). I G4 sono strutture secondarie non canoniche degli acidi nucleici che si formano in regioni genomiche ricche di guanine e prevalentemente nei promotori di geni attivamente trascritti, tra cui anche oncogeni. Nel contesto di WDLPS, i G4 presenti nel promotore di CDK4 sono stati caratterizzati tramite diversi approcci in vitro che hanno identificato una sequenza (chiamata CDK4-G4) come la più stabile. Un esperimento di pull-down proteico ha rilevato XRCC6/Ku70 come una delle proteine umane in grado di legare CDK4-G4 con maggiore significatività. Sebbene essa sia principalmente nota come componente del dimero Ku, essenziale per la riparazione del danno al doppio filamento di DNA, studi recenti hanno evidenziato molteplici ruoli per la forma monomerica di Ku70, tra cui la regolazione della trascrizione. Con il presente lavoro, il ruolo di Ku70 come proteina in grado di legare i G4 è stato investigato, sia in vitro che con un approccio su larga scala in tutto il genoma cellulare, analizzandone la specificità di interazione con CDK4-G4 ed il possibile effetto di tale legame sulla struttura. Quindi, è stata condotta un’analisi biofisica della sequenza di CDK4-G4 attraverso dicroismo circolare e saggi di stop della polimerasi, che hanno dimostrato la capacità di ripiegamento in G4 della sequenza e la presenza di un'interazione tra Ku70 e il G4 di CDK4-G4. In parallelo, l’associazione Ku70-G4 è stata investigata, mediante una tecnica innovativa di immunoprecipitazione della cromatina, chiamata CUT&Tag. Tale tecnica ha permesso di dimostrare l’effettiva co-localizzazione di Ku70 e di CDK4-G4 in cellule in assenza di danno al DNA e, contestualmente, ha posto le basi per estendere l’analisi a livello di tutti i G4 presenti nell’intero genoma cellulare, identificando nuovi possibili bersagli terapeutici per il trattamento di tumori difficilmente trattabili come WDLPS.