Studio preliminare dei trasportatori dell’ammonio nella microalga marina Nannochloropsis gaditana

Nannochloropsis gaditana è una microalga marina di interesse biotecnologico per la sua capacità di produrre triacilgliceroli, utilizzati come precursori per la produzione di biodiesel, e metaboliti ad alto valore aggiunto come clorofilla, carotenoidi e omega-3. Tuttavia, è necessario sviluppare sistemi di coltivazione che garantiscano costi di produzione sostenibili e rese sufficientemente elevate da competere con e, idealmente, sostituire i metodi tradizionali per la produzione di questi composti, basati ad esempio sui combustibili fossili. Ottimizzare la produttività delle microalghe è un obiettivo essenziale per superare queste limitazioni e rendere questa tecnologia matura per il mercato. La produttività delle microalghe dipende da diversi fattori, tra cui l'efficienza fotosintetica e il tasso di crescita, entrambi strettamente influenzati dalla disponibilità di nutrienti come l'azoto. Questo elemento chimico è fondamentale per il metabolismo, poiché costituisce le proteine, inclusi gli enzimi fotosintetici, responsabili della crescita fototrofica. Pertanto, una migliore comprensione del metabolismo dell'azoto risulta cruciale per ottimizzare la produttività delle microalghe. Tra le forme di azoto utilizzabili dalle alghe, l’ammonio (NH4+) è la forma più ridotta e quindi energeticamente più vantaggiosa; la sua assimilazione avviene tramite i trasportatori dell’ammonio (AMT). Questo progetto è focalizzato sullo studio dei trasportatori dell’ammonio di N. gaditana, con l’obiettivo di determinarne la localizzazione subcellulare e il ruolo nel processo di assimilazione dell’ammonio. A tal fine, sono state inizialmente individuate le sequenze geniche degli AMT; poiché risultavano incomplete, sono state ricostruite mediante metodi bioinformatici e successivamente confermate tramite sequenziamento. In seguito, sono stati generati mutanti sovra-espressori dei trasportatori AMT chimerici (AMT-OE) in fusione alla Yellow Fluorescent Protein (YFP), per determinarne la localizzazione subcellulare, e mutanti knock-out (AMT-KO) per indagarne il ruolo fisiologico. Questi mutanti sono stati ottenuti utilizzando tecniche di ingegneria genetica, come il sistema di genome editing CRISPR-Cas12a e il meccanismo di riparazione del DNA non omologo (NHEJ). Per ciascun trasportatore, sono stati isolati due ceppi indipendenti KO, mentre per i mutanti AMT-OE si è riusciti ad isolare solo i ceppi sovra-espressori i trasportatori chimerici AMT1 e AMT2. L’isolamento di un ceppo sovra-espressore il trasportatore chimerico AMT3 è ancora in corso. Mediante microscopia a fluorescenza si è visto che AMT2 si localizza a livello della membrana citoplasmatica, mentre AMT1 presenta una localizzazione intracellulare, suggerendo due ruoli distinti nel metabolismo dell’azoto in N. gaditana. Il mutante amt2 KO ha evidenziato un significativo difetto di crescita in presenza di ammonio rispetto al ceppo parentale, con un effetto maggiore al diminuire della concentrazione di ammonio nel mezzo di coltura, suggerendo che AMT2 sia un trasportatore ad alta affinità. Al contrario, il mutante amt1 KO non ha mostrato difetti significativi nella crescita in presenza di ammonio rispetto al ceppo parentale. Questi dati confermano le ipotesi avanzate durante gli esperimenti di localizzazione subcellulare, suggerendo che il trasportatore AMT2 abbia un ruolo nell’assimilazione di ammonio dall’ambiente, mentre AMT1 potrebbe essere coinvolto nella sua veicolazione intracellulare.