Influence of TP53 mutations and MSCs in MDS

Myelodysplastic syndromes (MDS) with TP53 mutations show poor therapeutic response, but the molecular mechanisms underlying treatment resistance, particularly in the context of bone marrow microenvironment interactions, remain poorly understood. While mesenchymal stromal cells (MSCs) are known to influence hematopoietic cell behavior, their combined effects with TP53 mutations on transcriptomic responses to cytarabine treatment have not been systematically characterized. This study employed CRISPR/Cas9-mediated genome engineering to create isogenic OCI-AML5 cell models with defined TP53 alterations (R175H missense and Stop nonsense mutations). A comprehensive experimental framework incorporated both monoculture and co-culture systems with HS27A mesenchymal stromal cells, with and without 500nM cytarabine treatment for 48 hours. RNA sequencing was performed on 34 high-quality samples using Illumina technology, generating paired-end reads with sequencing depths of 30-50 million read pairs per sample. A multi-dimensional computational pipeline was developed including de novo transcriptome assembly using Trinity, differential expression analysis with edgeR, pathway enrichment analysis with clusterProfiler, novel splice junction detection using both STAR and Rsubread aligners, and comprehensive SNV calling using GATK. Quality control measures included contamination assessment, assembly optimization, and rigorous filtering protocols. Analysis revealed convergent transcriptional effects between TP53 mutation types, confirmed MSC-mediated treatment protection, and identified TP53 status as a potential biomarker for splicing-targeted therapies. Unexpectedly, cytarabine treatment activated immune rather than DNA repair pathways, suggesting novel therapeutic mechanisms. This comprehensive transcriptomic approach provides a robust methodological framework for studying complex gene-environment-treatment interactions and offers molecular insights that may inform precision medicine strategies for TP53-mutated MDS patients.

Le sindromi mielodisplastiche (MDS) con mutazioni di TP53 mostrano una scarsa risposta terapeutica, ma i meccanismi molecolari alla base della resistenza al trattamento, in particolare nel contesto delle interazioni con il microambiente del midollo osseo, rimangono poco compresi. Sebbene sia noto che le cellule stromali mesenchimali (MSC) influenzano il comportamento delle cellule emopoietiche, i loro effetti combinati con le mutazioni di TP53 sulle risposte trascrittomiche al trattamento con citarabina non sono stati caratterizzati in modo sistematico. Questo studio ha utilizzato l'ingegneria genomica mediata da CRISPR/Cas9 per creare modelli cellulari OCI-AML5 isogenici con alterazioni definite di TP53 (mutazioni R175H missense e Stop nonsense). Un quadro sperimentale completo ha incorporato sistemi sia di monocoltura che di co-coltura con cellule stromali mesenchimali HS27A, con e senza trattamento con 500 nM di citarabina per 48 ore. Il sequenziamento dell'RNA è stato eseguito su 34 campioni di alta qualità utilizzando la tecnologia Illumina, generando letture paired-end con profondità di sequenziamento di 30-50 milioni di coppie di letture per campione. È stata sviluppata una pipeline computazionale multidimensionale che includeva l'assemblaggio de novo del trascrittoma utilizzando Trinity, l'analisi dell'espressione differenziale con edgeR, l'analisi dell'arricchimento dei pathway con clusterProfiler, la rilevazione di nuove giunzioni di splicing utilizzando allineatori STAR e Rsubread e la chiamata completa di SNV utilizzando GATK. Le misure di controllo qualità includevano la valutazione della contaminazione, l'ottimizzazione dell'assemblaggio e rigorosi protocolli di filtraggio. L'analisi ha rivelato effetti trascrizionali convergenti tra i tipi di mutazione di TP53, ha confermato la protezione del trattamento mediata da MSC e ha identificato lo stato di TP53 come potenziale biomarcatore per terapie mirate allo splicing. Inaspettatamente, il trattamento con citarabina ha attivato pathway immunitari piuttosto che di riparazione del DNA, suggerendo nuovi meccanismi terapeutici. Questo approccio trascrittomico completo fornisce un solido quadro metodologico per studiare le complesse interazioni gene-ambiente-trattamento e offre approfondimenti molecolari che possono orientare strategie di medicina di precisione per i pazienti con MDS con mutazione TP53.