Three-dimensional patterning for studying neural axon sprouting in a human neuromuscular system model

In vitro modelling of the human neuromuscular system has emerged as a powerful approach for investigating the neural and muscle development and disease mechanisms in a human-specific context. Recent advances in stem cell biology have enabled the use of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate three-dimensional multicellular constructs known as organoids, which are able to replicate key structural and functional features of the native tissues. Among these, neuromuscular organoids (NMOs), self-assembled spheroids composed of both muscular and neural integrated elements, provide a unique opportunity to study neuronal and muscular compartments and their communication. In this study, we employed a bioengineered system combining NMOs with three-dimensional patterned polydimethylsiloxane (PDMS) chambers and imaging analysis to evaluate myogenic cell delamination and neural axon sprouting from the spheroids. To do so, we set up multiple cell culture conditions, where NMO could be maintained in adhesion to promote cell sprouting. We found that these micro-fabricated structures guide and promote unidirectional muscle and neural axon sprouting organization. To validate this system, we employed a hiPSCs line knock-out (KO) for the HECW1 gene, which plays a role in axonal development, growth, and sprouting. Molecular analysis and imaging analysis were conducted to characterize the neuromuscular organoids as spheroids and upon culture into the patterned PDMS chambers. HECKW1 KO hiPSCs-derived NMOs revealed aberrant neuronal development and structural organization when compared with the isogenic hiPSC-derived NMOs, highlighting the potential of patterned culture systems as a platform to study the human neuromuscular system in vitro. Thus, we concluded that the combination of NMOs and patterned PDMS chambers offers a reproducible platform for studying myogenic cell delamination, neural axon growth, branching and pathfinding.

La modellazione in vitro del sistema neuromuscolare umano rappresenta un approccio potente e innovativo per indagare i processi di sviluppo del tessuto neuronale e muscolare, nonché i meccanismi alla base di diverse patologie, in un contesto specificamente umano. I recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali hanno reso possibile l’impiego delle cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) per la generazione di costrutti multicellulari tridimensionali, noti come organoidi, in grado di riprodurre caratteristiche morfo-funzionali fondamentali dei tessuti nativi. Tra questi, gli organoidi neuromuscolari (NMO) si sono dimostrati particolarmente utili per lo studio del compartimento neuronale e di quello muscolare, e le loro interazioni. In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema bioingegnerizzato che combina organoidi neuromuscolari (NMOs) e camere tridimensionali in polidimetilsilossano (PDMS) dotate di micro-pattern superficiale, integrato con analisi di imaging, per valutare il distacco delle cellule miogeniche e lo sprouting assonale dai corpi sferoidali. A tal fine, abbiamo allestito diverse condizioni di coltura cellulare, che permettessero agli NMOs di aderire alla superficie per favorire lo sprouting cellulare. Abbiamo osservato che queste strutture micro-fabbricate guidano e favoriscono un’organizzazione unidirezionale dello sprouting sia muscolare che assonale. Per validare il sistema, abbiamo impiegato una linea di hiPSC knock-out (KO) per il gene HECW1, noto per il suo ruolo nello sviluppo, nella crescita e nello sprouting degli assoni. Analisi molecolari e di imaging sono state condotte per caratterizzare gli NMOs derivati da questa linea KO, sia in forma sferoidale sia coltivati nelle camere in PDMS micro-strutturate. Gli NMOs derivati dalla linea KO hanno mostrato uno sviluppo neuronale e un’organizzazione strutturale aberranti rispetto agli NMOs isogenici derivati da hiPSC, evidenziando il potenziale dei sistemi di coltura mciro-strutturati come piattaforme per lo studio in vitro del sistema neuromuscolare umano. In conclusione, l’integrazione di NMOs e camere in PDMS micro-patternizzate si è dimostrata una piattaforma riproducibile per lo studio della migrazione delle cellule miogeniche, della crescita e ramificazione degli assoni e dei meccanismi di guida neuronale.