Elaborazione di una strategia per la produzione dei domini Zinc Finger PHD1 e PHD2 della proteina PHF6: basi per lo sviluppo di nuovi interattori di una proteina ampiamente disordinata coinvolta in patologie umane

Questo lavoro di tesi si inserisce in un progetto più ampio che ha l’obiettivo di studiare proteine contenenti regioni disordinate (IDR) implicate nelle neoplasie maligne infantili. Le IDP (Intrinsically Disordered Proteins) mancano di una struttura tridimensionale stabile e di siti di legame definiti, rendendole difficili da colpire farmacologicamente. Queste proteine, spesso coinvolte in interazioni proteina-proteina o proteina-DNA, comprendono oncogeni e oncosoppressori rilevanti come Ras, Myc e P53. In precedenza, dopo aver analizzato target biologici rilevanti e filtrato proteine con IDR confermati sperimentalmente e lunghezza contenuta, era stata selezionata PHF6 (Plant Homeodomain Finger 6). PHF6, codificata sul cromosoma Xq26–q27, è una proteina nucleare di 365 aa, con due domini PHD zinc finger atipici (PHD1 e PHD2), separati da un lungo loop disordinato. La proteina PHF6 è coinvolta in processi cruciali di regolazione trascrizionale e ha attirato l’interesse della comunità scientifica per il suo ruolo in patologie come la sindrome di Börjeson–Forssman–Lehmann e alcune forme di leucemia. Recentemente, è stata identificata come partner del complesso di rimodellamento della cromatina NurD, interagendo specificamente con RBBP4 attraverso i residui 152–171. Mutazioni in Arg163 e Lys164 di PHF6 compromettono questa interazione, suggerendo un ruolo chiave nel mantenimento dell’omeostasi cellulare. Metà delle mutazioni associate alle malattie sono distribuite nel secondo Plant HomeoDomain (e PHD2), del quale è stata determinata la struttura cristallina. Tale tesi sperimentale ha avuto come obiettivo il clonaggio, l’espressione e la purificazione dei domini PHD1 e PHD2 della proteina PHF6. Il clonaggio è stato effettuato mediante il metodo RF-cloning, partendo dal plasmide pET100/D-TOPO e utilizzando come vettore di destinazione pGEX-6P-1, che consente l’espressione dei domini in fusione con il tag GST (Glutathione S-Transferase). I costrutti ottenuti sono stati trasformati in cellule competenti E. coli BL21 (DE3), comunemente impiegate per l’espressione proteica eterologa. L’induzione dell’espressione è stata condotta con IPTG in presenza di ZnSO4 e successivamente si è proceduto alla lisi cellulare. Si è cercato quindi di mettere a punto una strategia di purificazione dei due domini mediante cromatografia di affinità su colonna GSTrap, sfruttando l’interazione specifica tra il tag GST e la fase stazionaria funzionalizzata con glutatione. L’efficacia dell’espressione e della purificazione è stata verificata tramite elettroforesi su gel SDS-PAGE. Tuttavia, i cromatogrammi e la successiva analisi mediante SDS-PAGE hanno mostrato scarsa resa del prodotto proteico, principalmente a causa di un accumulo nei corpi di inclusione e di una mancata interazione con la matrice della colonna. Per cercare di migliorare solubilità ed espressione, è stata quindi adottata una strategia alternativa utilizzando il vettore pET-SUMO, che prevede la fusione con il tag SUMO, noto per aumentare la stabilità e favorire la corretta conformazione delle proteine ricombinanti. In conclusione, i risultati ottenuti finora rappresentano un primo passo verso analisi strutturali approfondite (es. NMR o cristallografia a raggi X), fondamentali per chiarire il ruolo di PHF6 e il suo potenziale come target terapeutico.