Exploring and Optimizing Secondary Metabolite Biosynthesis in Cannabis sativa through Inducible Systems and Genetic Engineering.

Cannabis sativa, part of the Cannabaceae family, is known for its extensive production of secondary metabolites, mainly produced and secreted in the glandular trichomes of female inflorescences. Glandular trichomes are hairs made up of multicellular structures from the epidermis on the aerial parts of plants, playing a role in stress resistance. Among the many compounds of interest produced by Cannabis sativa, cannabinoids stand out as bioactive molecules that have generated significant economic interest due to their pharmaceutical properties. A large amount of research has been initiated since the discovery of cannabidiol (CBD), valued for its lack of psychoactive effects, to better understand the biosynthetic pathway and to enhance cannabinoid production through synthetic biology and genetic engineering. However, the limited knowledge regarding genetic and biological mechanisms, the lack of efficient protocols for the in vitro regeneration, and the recalcitrant nature of the species to the genetic transformation still pose numerous obstacles. In our laboratory, we achieved stable transformation of Cannabis cells from suspension cultures using a Biolistic protocol, resulting in cell lines each expressing a transcription factor (TF) from different gene families. The transactivation of these TFs induces cell differentiation and activates the cannabinoid biosynthetic pathway. This transactivation has been achieved through a dual system, pOp6/LhGR, which comprises a driver construct (P_green_LhGR) and a responder construct (pHTOP), triggered by Dexamethasone (DEX). Additionally, the optimized induction protocol for our cell lines involves the combined use of DEX and methyl-jasmonate (MeJa). This research project aims to thoroughly investigate and optimize the system by conducting further analyses on the obtained cell lines. Gene expression fluctuations following induction treatment were evaluated in suspension-cultured cells, each modified with a pair of TFs from different gene families. qRT-PCR analyses were performed on both endogenous and exogenous genes involved in trichome differentiation (CsHD8, CsMIXTA1) and cannabinoid biosynthesis (CsGPPS, CsOLS). The results indicated a partial achievement of the intended objectives, despite notable variability and instability across the cell lines. In parallel, an investigation was conducted on an in-solid culture system, in which TF induction is enabled through a solid physical interface that supports trichome formation. Following optimization of the in-solid induction protocol, we observed specific cell morphologies distinct from wild-type (WT), characterized by an elongated shape and apical swelling, resembling trichome structures. The performance of this induction system was validated through qRT-PCR analyses targeting genes of interest. These cell lines were subsequently used in a metabolic engineering strategy leveraging the well-established CRISPR-Cas9 genome editing system. The selected targets are two paralogous genes, which encode the enzyme Farnesyl Pyrophosphate Synthase (FPPS). This enzyme catalyzes the initial step in the sesquiterpene biosynthetic pathway by utilizing the cytosolic pool of Isopentenyl Pyrophosphate (IPP) and Dimethylallyl Pyrophosphate (DMAPP) as substrates. A parallel plastid pool of IPP and DMAPP serves as a substrate for the enzyme Geranyl Pyrophosphate Synthase (GPPS), a key catalyst in cannabinoid biosynthesis. The generated edited cells are expected to accumulate an increased plastid pool of IPP and DMAPP, due to the demonstrated presence of transporters across the plastid membrane. This scenario is anticipated to enhance monoterpene production and, hopefully, cannabinoid output as well. The protocol involves the design of two guide RNAs per target gene, all assembled into a single vector (p_Direct23C) using Golden Gate cloning. The transformation will be carried out via a biolistic method, employing Glufosinate Ammonium as the selective agent.

Cannabis sativa, appartenente alla Cannabaceae, è nota per l’elevata e diversificata produzione di molecole del metabolismo secondario, prevalentemente sintetizzate e secrete nei tricomi ghiandolari delle infiorescenze femminili. Tra i composti prodotti vi sono i cannabinoidi, molecole bioattive che hanno suscitato grande interesse economico in seguito alla scoperta delle proprietà farmaceutiche, ma non psicoattive, del cannabidiolo (CBD). Tale scoperta ha avviato numerosi studi sulla regolazione di tale via biosintetica e sull’identificazione di strategie per potenziarne produttività e resa, tramite l’uso della biologia sintetica e dell’ingegneria metabolica. Tuttavia, la limitata conoscenza dei meccanismi genetici e molecolari, la carenza di protocolli efficaci per la rigenerazione in vitro e la natura recalcitrante della specie alla trasformazione, pongono ancora numerosi ostacoli. Mediante un protocollo di biolistica, abbiamo ottenuto la trasformazione stabile di colture in sospensione di Cannabis, generando linee cellulari ciascuna esprimente un fattore di trascrizione (TF) appartenente a famiglie geniche diverse. La loro trans-attivazione induce il differenziamento cellulare e la conseguente attivazione della via biosintetica dei cannabinoidi. La trans-attivazione dei TF avviene tramite un sistema duale, pOp6/LhGR, composto da un costrutto driver (P_green_LhGR) e un responder (pHTOP). Il sistema è inducibile con dexametasone (DEX) e il nostro protocollo di induzione ottimizzato ne prevede l’uso combinato con il Metil-Jasmonato (MeJa). Il presente progetto di ricerca mira ad approfondire e ottimizzare il sistema mediante ulteriori analisi sulle linee cellulari ottenute. Colture cellulari, ciascuna modificata con una coppia di TF appartenenti a famiglie geniche diverse, sono state sottoposte a trattamenti di induzione per caratterizzare le variazioni nell’espressione genica. Le analisi di qRT-PCR sui geni esogeni, geni endogeni coinvolti nel differenziamento del tricoma (CsHD8, CsMIXTA1) e nella sintesi dei cannabinoidi (CsGPPS, CsOLS) mostrano un parziale raggiungimento degli obiettivi, nonostante un’elevata variabilità e instabilità delle linee. Parallelamente, è stato sviluppato un sistema di crescita in-solido che consenta la trans-attivazione dei TF e la formazione della struttura tricomatica grazie alla presenza di un’interfaccia fisica favorevole. L’ottimizzazione del sistema ha portato all’osservazione di cellule con morfologia distinta dalle WT, caratterizzate da una forma allungata e un rigonfiamento apicale, simile al tricoma. Analisi di qRT-PCR sui geni di interesse sono state eseguite per valutare l’efficacia del sistema di induzione. Su queste linee cellulari è stato progettato un intervento di ingegneria metabolica basato sul sistema di editing genetico CRISPR-Cas9. I target selezionati sono due geni paraloghi codificanti per l’enzima Farnesil Pirofosfato Sintasi (FPPS), il quale catalizza il primo passaggio nella biosintesi dei sesquiterpeni, utilizzando il pool citoplasmatico di Isopentenil Pirofosfato (IPP) e Dimetilallil Pirofosfato (DMAPP). Un analogo pool plastidiale serve invece da substrato per l’enzima Geranil Pirofosfato Sintasi (GPPS), chiave nella via di sintesi dei cannabinoidi. I mutanti generati disporranno presumibilmente di un pool plastidiale di IPP e DMAPP più abbondante, grazie alla presenza dimostrata di trasportatori di membrana plastidiale, con un’attesa maggiore produzione di mono-terpeni, e potenzialmente anche di cannabinoidi. L’approccio prevede la creazione di due guide RNA per ciascun gene, l’inserzione in un unico vettore (P-Direct23C) tramite Golden Gate Assembly, e la successiva trasformazione delle cellule mediante il protocollo di biolistica.