Large Granular Lymphocyte Leukaemia (T-LGLL) is a rare haematologic malignancy characterized by the clonal proliferation of cytotoxic T cells known as Large Granular Lymphocytes (LGLs). T-LGL exhibits a STAT-3 mutated phenotype that leads to downregulation in the expression of miR-146b which is the causative factor of neutropenia. Restoring physiological intracellular levels of miR-146b has been proposed as a promising therapeutic strategy for T-LGLL. The aim of this project is to develop an efficient nanocarrier system for targeted delivery of this miRNA into T cells. To enable active targeting, lipid nanoparticles (LNPs) loaded with miRNA will be functionalized with a Fab’ specific for CD57, a surface receptor selectively expressed by T-LGL cells. A library of LNPs formulations was obtained using an oligocationic enhancer (OCE), SM-102 as ionizable lipid for endosomal escape, cholesterol, phospholipid, PEG-phospholipid. The LNP library was generated by loading Cyanine-5-labeled miRNA at increasing N/P ratios (1 to 10). To produce LNPs, a microfluidic approach was selected to process the lipid mixture. Increasing ratio (0–7 mol%) of DSPEpHsheddable-mPEG2kDa (PEG-lipid) with respect to total lipids were included. PEGylated LNPs had a size of approximately 100 nm at 5 and 7 mol% DSPEpHsheddable-mPEG2kDa. The zeta potential of LNPs decreased with increasing PEG-lipid percentage and increased as the N/P ratio increased. Loading efficiency exceeded 80% at N/P ≥ 4, while lower ratios showed reduced efficiency (<50%) but higher loading capacity. Given these results LNPs with N/P ≥ 4 were selected for further studies. PEGylated LNPs with 5 and 7 mol% PEG-lipid loaded with model anti-eGFP siRNA at 4-10 N/P ratio displayed similar silencing regardless the N/P ratio. Based on the loading features the LNPs generated with N/P 4 were selected for in vivo testing. In BALB/c mice, intravenous administration of both 5 and 7 mol% PEGylated LNPs showed no renal or hepatic toxicity while pharmacokinetic analysis revealed that 7 mol% PEG LNPs exhibited prolonged circulation time, identifying it as the optimal scaffold for further functionalization with CD57 ligand. Preliminary studies were focused on testing the CD57 receptor internalization, which is a requisite to enable intracellular delivery of therapeutic agents. Internalization was tested on Jurkat cells, a T-lymphocytes-derived cell line expressing CD57. Clone QA17A04 was selected and we elucidated the mechanism of its internalization: endocytosis was strongly inhibited (-38 % uptake) by Dyngo, a dynamin-dependent endocytosis inhibitor, and sodium azide (-60 % uptake), indicating that CD57 is internalized via an energy-dependent, dynamin-mediated endocytic pathway. Antibody internalization was further confirmed by confocal microscopy. The conjugation procedure of antibody to LNP was set up using a model rabbit isotype IgG. The IgG was enzymatically cleaved by pepsin to obtain the F(ab’)2 fragment. Following, interchain disulfide bonds were reduced and the exposed thiol groups were reacted with DSPE-mPEG3.4kDa-Maleimide. Fragments and the final product were purified and analysed by SEC and SDS-PAGE analysis, and they confirmed the expected MW for fragments and conjugate obtained by proteolysis, reduction and conjugation. DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ and DSPEpHsheddable-mPEG2kDa were assembled simultaneously on LNPs surface after microfluidic production at 0.5 mol% and 6.5 mol%, and 1 mol% and 6 mol% respectively. LNPs decorated with 0.5 mol% DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ was selected for its superior colloidal properties. In vitro tests were performed on Jurkat cells using both Fab’-decorated and Fab’-free LNPs. Cytotoxicity assays, cellular association studies and confocal microscopy imaging of LNPs revealed, as expected, negligible toxicity, internalization of the PEGylated and Fab’-decorated LNPs with respect to the non-PEGylated formulations proving the good stealth features.

La Leucemia a Grandi Linfociti Granulari (T-LGLL) è una rara neoplasia ematologica caratterizzata dalla proliferazione di linfociti T citotossici noti come grandi linfociti granulari (LGLs). Le cellule T-LGL presentano un fenotipo mutato di STAT-3 che riduce l’espressione di miR-146b, il fattore causale della neutropenia. Il ripristino dei livelli fisiologici intracellulari di miR-146b è stato proposto come strategia terapeutica per la T-LGLL. L’obiettivo di questo progetto è sviluppare un sistema di nanovettori per la veicolazione mirata di questo miRNA nelle cellule T. Per consentire il targeting, le nanoparticelle lipidiche (LNPs) caricate con miRNA saranno funzionalizzate con un frammento Fab’ specifico per CD57, un recettore espresso dalle cellule T-LGL.È stata ottenuta una libreria di formulazioni di LNPs utilizzando un oligocationic enhancer (OCE), SM-102 come lipide ionizzabile per la fuga endosomiale, colesterolo, fosfolipidi e PEG-fosfolipidi. La libreria è stata generata caricando miRNA marcato con cianina-5 a rapporti N/P crescenti (da 1 a 10). La produzione delle LNPs è stata eseguita in microfluidica, processando la miscela lipidica con rapporti crescenti (0–7 mol%) di DSPE-pHsheddable-mPEG2kDa (PEG-lipide) rispetto ai lipidi totali. Le LNPs PEGilate hanno mostrato dimensioni di circa 100 nm a 5 e 7 mol% di DSPE-pHsheddable-mPEG2kDa. Il potenziale zeta diminuiva all’aumentare della percentuale di PEG-lipide e aumentava con l’aumento del rapporto N/P. L’efficienza di caricamento superava l’80% per N/P ≥ 4, mentre rapporti inferiori mostravano efficienze ridotte (<50%) ma maggiore capacità di caricamento. Sulla base di questi risultati, le LNPs con N/P ≥ 4 sono state selezionate per ulteriori studi. Le LNPs PEGilate al 5 e 7 mol% caricate con siRNA anti-eGFP modello (a rapporto N/P 4–10) hanno mostrato un silenziamento simile indipendentemente dal rapporto N/P. Considerando le proprietà di caricamento, le LNPs con N/P 4 sono state selezionate per test in vivo. Nei topi BALB/c, la somministrazione endovenosa di LNPs PEGilate al 5 e 7 mol% non ha mostrato tossicità renale o epatica, mentre l’analisi farmacocinetica ha rivelato che le LNPs con 7 mol% di PEG avevano maggiore biodisponibilità, identificandole come scaffold ottimale. Studi preliminari si sono concentrati sulla verifica dell’internalizzazione del recettore CD57, requisito necessario per la veicolazione intracellulare. L’internalizzazione è stata testata su cellule Jurkat, una linea cellulare che esprime CD57. È stato selezionato il clone QA17A04 e il meccanismo della sua internalizzazione è stato chiarito: l’endocitosi è risultata fortemente inibita da Dyngo, e dal sodio azide, indicando che CD57 viene internalizzato tramite un processo endocitico dinamino- e energia-dipendente. L’internalizzazione è stata confermata mediante microscopia confocale. La procedura di coniugazione dell’anticorpo alle LNPs è stata impostata utilizzando un IgG di coniglio come modello. L’IgG è stata proteolizzata per ottenere il frammento F(ab’)2. I ponti disolfuro sono stati ridotti ed i gruppi tiolici sono stati fatti reagire con DSPE-mPEG3.4kDa-Mal. I frammenti e il prodotto finale sono stati purificati e analizzati mediante SEC e SDS-PAGE, confermando il peso molecolare atteso. DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ e DSPE-pHsheddable-mPEG2kDa sono stati assemblati sulla superficie delle LNPs rispettivamente a 0,5 mol% e 6,5 mol%, e a 1 mol% e 6 mol%. Le LNPs decorate con 0,5 mol% di DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ sono state selezionate per le migliori proprietà colloidali. Test in vitro condotti su cellule Jurkat con LNPs decorate e non decorate con Fab’ hanno mostrato, tramite saggi di citotossicità, studi di associazione cellulare e microscopia confocale, una tossicità trascurabile e una bassa internalizzazione delle formulazioni PEGilate e decorate con Fab’, a conferma delle buone proprietà “stealth”.

Engineering targeted lipid nanoparticles for miRNA delivery in the treatment of leukaemias

SCOCCIA, ELENA
2024/2025

Abstract

Large Granular Lymphocyte Leukaemia (T-LGLL) is a rare haematologic malignancy characterized by the clonal proliferation of cytotoxic T cells known as Large Granular Lymphocytes (LGLs). T-LGL exhibits a STAT-3 mutated phenotype that leads to downregulation in the expression of miR-146b which is the causative factor of neutropenia. Restoring physiological intracellular levels of miR-146b has been proposed as a promising therapeutic strategy for T-LGLL. The aim of this project is to develop an efficient nanocarrier system for targeted delivery of this miRNA into T cells. To enable active targeting, lipid nanoparticles (LNPs) loaded with miRNA will be functionalized with a Fab’ specific for CD57, a surface receptor selectively expressed by T-LGL cells. A library of LNPs formulations was obtained using an oligocationic enhancer (OCE), SM-102 as ionizable lipid for endosomal escape, cholesterol, phospholipid, PEG-phospholipid. The LNP library was generated by loading Cyanine-5-labeled miRNA at increasing N/P ratios (1 to 10). To produce LNPs, a microfluidic approach was selected to process the lipid mixture. Increasing ratio (0–7 mol%) of DSPEpHsheddable-mPEG2kDa (PEG-lipid) with respect to total lipids were included. PEGylated LNPs had a size of approximately 100 nm at 5 and 7 mol% DSPEpHsheddable-mPEG2kDa. The zeta potential of LNPs decreased with increasing PEG-lipid percentage and increased as the N/P ratio increased. Loading efficiency exceeded 80% at N/P ≥ 4, while lower ratios showed reduced efficiency (<50%) but higher loading capacity. Given these results LNPs with N/P ≥ 4 were selected for further studies. PEGylated LNPs with 5 and 7 mol% PEG-lipid loaded with model anti-eGFP siRNA at 4-10 N/P ratio displayed similar silencing regardless the N/P ratio. Based on the loading features the LNPs generated with N/P 4 were selected for in vivo testing. In BALB/c mice, intravenous administration of both 5 and 7 mol% PEGylated LNPs showed no renal or hepatic toxicity while pharmacokinetic analysis revealed that 7 mol% PEG LNPs exhibited prolonged circulation time, identifying it as the optimal scaffold for further functionalization with CD57 ligand. Preliminary studies were focused on testing the CD57 receptor internalization, which is a requisite to enable intracellular delivery of therapeutic agents. Internalization was tested on Jurkat cells, a T-lymphocytes-derived cell line expressing CD57. Clone QA17A04 was selected and we elucidated the mechanism of its internalization: endocytosis was strongly inhibited (-38 % uptake) by Dyngo, a dynamin-dependent endocytosis inhibitor, and sodium azide (-60 % uptake), indicating that CD57 is internalized via an energy-dependent, dynamin-mediated endocytic pathway. Antibody internalization was further confirmed by confocal microscopy. The conjugation procedure of antibody to LNP was set up using a model rabbit isotype IgG. The IgG was enzymatically cleaved by pepsin to obtain the F(ab’)2 fragment. Following, interchain disulfide bonds were reduced and the exposed thiol groups were reacted with DSPE-mPEG3.4kDa-Maleimide. Fragments and the final product were purified and analysed by SEC and SDS-PAGE analysis, and they confirmed the expected MW for fragments and conjugate obtained by proteolysis, reduction and conjugation. DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ and DSPEpHsheddable-mPEG2kDa were assembled simultaneously on LNPs surface after microfluidic production at 0.5 mol% and 6.5 mol%, and 1 mol% and 6 mol% respectively. LNPs decorated with 0.5 mol% DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ was selected for its superior colloidal properties. In vitro tests were performed on Jurkat cells using both Fab’-decorated and Fab’-free LNPs. Cytotoxicity assays, cellular association studies and confocal microscopy imaging of LNPs revealed, as expected, negligible toxicity, internalization of the PEGylated and Fab’-decorated LNPs with respect to the non-PEGylated formulations proving the good stealth features.
2024
Engineering targeted lipid nanoparticles for miRNA delivery in the treatment of leukaemias
La Leucemia a Grandi Linfociti Granulari (T-LGLL) è una rara neoplasia ematologica caratterizzata dalla proliferazione di linfociti T citotossici noti come grandi linfociti granulari (LGLs). Le cellule T-LGL presentano un fenotipo mutato di STAT-3 che riduce l’espressione di miR-146b, il fattore causale della neutropenia. Il ripristino dei livelli fisiologici intracellulari di miR-146b è stato proposto come strategia terapeutica per la T-LGLL. L’obiettivo di questo progetto è sviluppare un sistema di nanovettori per la veicolazione mirata di questo miRNA nelle cellule T. Per consentire il targeting, le nanoparticelle lipidiche (LNPs) caricate con miRNA saranno funzionalizzate con un frammento Fab’ specifico per CD57, un recettore espresso dalle cellule T-LGL.È stata ottenuta una libreria di formulazioni di LNPs utilizzando un oligocationic enhancer (OCE), SM-102 come lipide ionizzabile per la fuga endosomiale, colesterolo, fosfolipidi e PEG-fosfolipidi. La libreria è stata generata caricando miRNA marcato con cianina-5 a rapporti N/P crescenti (da 1 a 10). La produzione delle LNPs è stata eseguita in microfluidica, processando la miscela lipidica con rapporti crescenti (0–7 mol%) di DSPE-pHsheddable-mPEG2kDa (PEG-lipide) rispetto ai lipidi totali. Le LNPs PEGilate hanno mostrato dimensioni di circa 100 nm a 5 e 7 mol% di DSPE-pHsheddable-mPEG2kDa. Il potenziale zeta diminuiva all’aumentare della percentuale di PEG-lipide e aumentava con l’aumento del rapporto N/P. L’efficienza di caricamento superava l’80% per N/P ≥ 4, mentre rapporti inferiori mostravano efficienze ridotte (<50%) ma maggiore capacità di caricamento. Sulla base di questi risultati, le LNPs con N/P ≥ 4 sono state selezionate per ulteriori studi. Le LNPs PEGilate al 5 e 7 mol% caricate con siRNA anti-eGFP modello (a rapporto N/P 4–10) hanno mostrato un silenziamento simile indipendentemente dal rapporto N/P. Considerando le proprietà di caricamento, le LNPs con N/P 4 sono state selezionate per test in vivo. Nei topi BALB/c, la somministrazione endovenosa di LNPs PEGilate al 5 e 7 mol% non ha mostrato tossicità renale o epatica, mentre l’analisi farmacocinetica ha rivelato che le LNPs con 7 mol% di PEG avevano maggiore biodisponibilità, identificandole come scaffold ottimale. Studi preliminari si sono concentrati sulla verifica dell’internalizzazione del recettore CD57, requisito necessario per la veicolazione intracellulare. L’internalizzazione è stata testata su cellule Jurkat, una linea cellulare che esprime CD57. È stato selezionato il clone QA17A04 e il meccanismo della sua internalizzazione è stato chiarito: l’endocitosi è risultata fortemente inibita da Dyngo, e dal sodio azide, indicando che CD57 viene internalizzato tramite un processo endocitico dinamino- e energia-dipendente. L’internalizzazione è stata confermata mediante microscopia confocale. La procedura di coniugazione dell’anticorpo alle LNPs è stata impostata utilizzando un IgG di coniglio come modello. L’IgG è stata proteolizzata per ottenere il frammento F(ab’)2. I ponti disolfuro sono stati ridotti ed i gruppi tiolici sono stati fatti reagire con DSPE-mPEG3.4kDa-Mal. I frammenti e il prodotto finale sono stati purificati e analizzati mediante SEC e SDS-PAGE, confermando il peso molecolare atteso. DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ e DSPE-pHsheddable-mPEG2kDa sono stati assemblati sulla superficie delle LNPs rispettivamente a 0,5 mol% e 6,5 mol%, e a 1 mol% e 6 mol%. Le LNPs decorate con 0,5 mol% di DSPE-mPEG3.4kDa-Fab’ sono state selezionate per le migliori proprietà colloidali. Test in vitro condotti su cellule Jurkat con LNPs decorate e non decorate con Fab’ hanno mostrato, tramite saggi di citotossicità, studi di associazione cellulare e microscopia confocale, una tossicità trascurabile e una bassa internalizzazione delle formulazioni PEGilate e decorate con Fab’, a conferma delle buone proprietà “stealth”.
Lipid Nanoparticles
Microfluidics
Active targeting
Leukemia
miRNA delivery
SALMASO, STEFANO
Lauree magistrali
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