Produzione e studi strutturali della proteina Mpro di SARS-CoV-2

The main protease (Mpro) of SARS-CoV-2 is a key enzyme involved in the maturation of viral polyproteins and thus plays a crucial role in the viral replication cycle. For this reason, it represents one of the primary pharmacological targets for the development of novel antiviral drugs. The catalytic activity of Mpro relies on a catalytic dyad composed of residues Cys145 and His41, whose proper spatial arrangement, together with that of the so-called oxyanion loop, is essential for the cleavage of viral polyproteins. The protein functions as a homodimer, with one active site per monomer and its enzymatic activity depends on the correct structural organization of the catalytic site. A critical role is played by the oxyanion loop, which contributes to the stabilization of the acyl tetrahedral transition state during catalysis and is therefore essential for catalytic efficiency. Recent studies have identified a new inactive conformation of the enzyme, referred to as “new-inactive”, in which the oxyanion loop adopts a structure significantly different from both the active form and previously described inactive con- formations. Although still capable of binding substrates, this conformation is catalytically inactive due to misalignment of the active site. This discovery opens new pathways for structure-based drug discovery, as the rearrangement of the site and the formation of a novel cavity near the site provide opportunities for the design of innovative inhibitors that selectively bind the inactive form and suppress enzymatic activity. In this thesis project, one Mpro mutant, Phe140Pro, was designed and characterized with the aim of stabilizing the “new-inactive” conformation. The mutant was successfully purified, crystallized and structurally analyzed in its free form and in complex with the inhibitor VC2, which was specifically designed to stabilize this conformation. The results obtained offer new insights into the conformational flexibility of the SARS-CoV-2 main protease.

La Main proteasi (Mpro) di SARS-CoV-2 è un enzima fondamentale per la mat- urazione delle poliproteine virali e riveste un ruolo cruciale nel ciclo replicativo del virus. Per questo motivo, rappresenta uno dei principali bersagli farmacologici nello sviluppo di nuovi farmaci antivirali. L’attività catalitica della proteasi si basa su una diade formata dai residui Cys145 e His41, il cui corretto posizionamento, insieme a quella del cosiddetto ”oxyanion loop”, è essenziale per il taglio delle poliproteine virali. La proteina è attiva in forma di omodimero, con un sito attivo per ciascun monomero e la sua funzionalità dipende dalla corretta organizzazione strutturale del sito catalitico. Un ruolo determinante è svolto dall’oxyanion loop, che consente la stabilizzazione dello stato di transizione acilico, risultando quindi cruciale per l’efficienza catalitica. In studi recenti è stata identificata una nuova conformazione inattiva dell’enzima, denominata ”new-inactive”, in cui l’oxyanion loop assume una struttura profondamente diversa rispetto sia alla forma attiva sia alle altre forme inattive finora descritte. Sebbene in grado di legare substrati, questa conformazione risulta cataliticamente inattiva a causa di un disallineamento del sito attivo. Tale scoperta offre nuove prospettive per la ”structure-based drug discovery”, poiché il riarrangiamento del sito e la formazione di una nuova cavità vicino aprono la possibilità di progettare inibitori innovativi in grado di legarsi selettivamente alla forma inattiva e inibire l’attività proteica. Nel presente lavoro di tesi è stato progettato e caratterizzato un mutante della proteasi, Phe140Pro, con l’obiettivo di stabilizzare la conformazione ”new-inactive”. Il mutante è stato purificato, cristallizzato e analizzato a livello strutturale, sia nella forma libera sia in complesso con l’inibitore VC2. I risultati ottenuti forniscono nuove informazioni sulla flessibilità conformazionale della Main proteasi.