Indagine sul complesso della piruvato deidrogenasi con marcatura basata sul dietil pirocarbonato.

The pyruvate dehydrogenase complex (PDHc) is a central hub of cellular energy metabolism. This thesis investigates whether, beyond E3BP-mediated anchoring, the hE1p subunit can directly interact with human dihydrolipoamide dehydrogenase (hE3), analogously to the E1k–E3 contact in KGDHc. We combined calibrated size-exclusion chromatography (SEC), diethyl pyrocarbonate (DEPC) covalent labeling coupled to LC–MS, and fluorescence anisotropy (FITC) titrations. SEC confirmed tetrameric hE1p and dimeric hE3; co-incubation produced an earlier elution peak consistent with a low-affinity transient complex. The L64F-hE1p variant lacked this behavior, indicating a critical role of L64 at or near the interface. DEPC footprinting on hE1p revealed decreased labeling at α12, α133, α307, α341, α357 and β23, β34, β318, β326; in hE3, the presence of hE1p increased accessibility of peptides containing residues 152 and 249, consistent with interaction-induced conformational changes. Overall, the data support a weak yet specific hE1p–hE3 interaction—likely conserved—that contributes to PDHc’s dynamic organization while not constituting the primary mechanism for E3 recruitment.

Il complesso della piruvato deidrogenasi (PDHc) è un nodo centrale del metabolismo energetico. Questa tesi esplora se, oltre all’ancoraggio mediato da E3BP, la subunità hE1p possa interagire direttamente con la diidrolipoamide deidrogenasi hE3, in analogia con l’interazione E1k–E3 nel KGDHc. Sono stati impiegati approcci complementari: cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) calibrata, marcatura covalente con dietil pirocarbonato (DEPC) accoppiata a LC–MS e titolazioni di anisotropia fluorescente (FITC). SEC ha confermato hE1p tetramerica e hE3 dimerica; la co-incubazione ha generato un picco anticipato, indicativo di un complesso transitorio a bassa affinità. La mutante L64F-hE1p non ha mostrato tale comportamento, suggerendo un ruolo critico del residuo L64 nell’interfaccia. Il footprinting DEPC di hE1p ha evidenziato riduzioni di marcatura in α12, α133, α307, α341, α357 e β23, β34, β318, β326; su hE3, l’interazione con hE1p ha aumentato l’accessibilità dei peptidi contenenti i residui 152 e 249, coerente con rimodellamenti conformazionali. Nel complesso, i dati supportano un’interazione hE1p–hE3 debole ma specifica, potenzialmente conservata, che contribuisce all’organizzazione dinamica dell’hPDHc senza rappresentare il principale meccanismo di reclutamento di E3.