Ingegnerizzazione di modelli 3D di Microambienti Tumorali compartimentalizzati

Understanding the complex interactions between cells and the stromal microenvironment is a key element for the development of predictive models of neoplastic progression and for the identification of new therapeutic strategies. In particular, three-dimensional (3D) in vitro models, such as organoids and spheroids, offer a more biologically and mechanically realistic representation than two-dimensional (2D) models, replicating the tissue architecture and cell-cell and cell-matrix interactions typical of solid tumors. This thesis work focused on the design, generation and characterization of biomimetic 3D models of breast tissue, with particular attention to the role of the stromal microenvironment in modulating cellular behavior. A systematic comparison between non-tumor and tumoral mammary epithelial cells was conducted in order to comparatively evaluate the impact of the microenvironment on the different physiopathological conditions. To this end, two human mammary epithelial cell lines were used: MCF10A, non-tumorigenic, and MCF10A-HER2+, engineered to overexpress the HER2 receptor, associated with an aggressive tumor phenotype. Cells were initially cultured in suspension in Matrigel, using low-adhesion multiwells, to promote self-organization in spheroidal and organoid structures, subsequently embedded in three-dimensional matrices based on hyaluronic acid (HA) and type I collagen. This hydrogel matrix was designed to mimic the mechanical and biochemical characteristics of the extracellular matrix (ECM), with the possibility of modulating the stiffness through rheological parameters, in order to replicate different physiopathological conditions. To reconstruct a stromal microenvironment, human dermal fibroblasts (WI38) were directly incorporated into the matrix. Two experimental conditions were created: one with the presence of fibroblasts and one without, allowing the direct comparison between the effect of the stroma on tumor and non-tumor cells. This approach allowed us to simulate signals and cell–matrix interactions closer to the in vivo context, highlighting the essential role of the stromal component in regulating the cellular phenotype, in both conditions. The morphological and structural characterization of organoids and spheroids was conducted by bright-field optical microscopy and confocal microscopy. Viability assays (live/dead) and immunofluorescence analyses were performed to evaluate the expression of molecular markers associated with tumor progression and matrix remodeling. Statistical analyses compared the responses of healthy and tumoral structures, with particular attention to growth and morphology. Observations showed that the presence of fibroblasts in the matrix induces significant changes in morphology, cellular organization and potential, suggesting a dynamic and active interaction between cells and stroma. The collected data show how the modulation of the mechanical and cellular properties of the matrix directly affects the growth, architecture and phenotypic behavior of cells, in a comparative perspective between healthy and pathological conditions. The developed model, while maintaining a lower level of complexity compared to the in vivo tumor microenvironment, represents a reproducible and adaptable system for the analysis of epithelium-stroma interactions. Furthermore, it constitutes a promising platform for future applications in high-resolution drug screening, personalized medicine and preclinical research in oncology.

La comprensione delle complesse interazioni tra cellule e microambiente stromale rappresenta un elemento chiave per lo sviluppo di modelli predittivi della progressione neoplastica e per l’identificazione di nuove strategie terapeutiche. In particolare, i modelli tridimensionali (3D) in vitro, quali organoidi e sferoidi, offrono una rappresentazione biologicamente e meccanicamente più realistica rispetto ai modelli bidimensionali (2D), replicando l’architettura del tessuto e le interazioni cellula–cellula e cellula–matrice tipiche dei tumori solidi. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sulla progettazione, generazione e caratterizzazione di modelli 3D biomimetici di tessuto mammario, con particolare attenzione al ruolo del microambiente stromale nella modulazione del comportamento cellulare. È stato sistematicamente condotto un confronto tra cellule epiteliali mammarie non tumorali e tumorali, al fine di valutare in modo comparativo l’impatto del microambiente sulle diverse condizioni fisiopatologiche. A tal fine, sono state impiegate due linee cellulari epiteliali mammarie umane: MCF10A, non tumorigenica, e MCF10A-HER2+, ingegnerizzata per sovraesprimere il recettore HER2, associato a un fenotipo tumorale aggressivo. Le cellule sono state coltivate inizialmente in sospensione in Matrigel, tramite multiwell low-adhesion, per favorire l’auto-organizzazione in strutture sferoidali e organoidi, successivamente inglobate in matrici tridimensionali a base di acido ialuronico (HA) e collagene di tipo I. Questa matrice di idrogel è stata progettata per simulare le caratteristiche meccaniche e biochimiche della matrice extracellulare (ECM), con possibilità di modulazione della rigidità tramite parametri reologici, al fine di replicare condizioni fisiopatologiche differenti. Per ricostruire un microambiente stromale, fibroblasti dermici umani (WI38) sono stati incorporati direttamente nella matrice. Sono state create due condizioni sperimentali: una con presenza di fibroblasti e una senza, permettendo il confronto diretto tra l’effetto dello stroma su cellule tumorali e non tumorali. Questo approccio ha consentito di simulare segnali e interazioni cellula–matrice più vicine al contesto in vivo, evidenziando il ruolo essenziale della componente stromale nella regolazione del fenotipo cellulare, in entrambe le condizioni. La caratterizzazione morfologica e strutturale degli organoidi e sferoidi è stata condotta mediante microscopia ottica in campo chiaro e microscopia confocale. Sono stati eseguiti saggi di vitalità (live/dead) e analisi di immunofluorescenza per valutare l’espressione di marcatori molecolari associati alla progressione tumorale e al rimodellamento della matrice. Le analisi statistiche hanno messo in comparazione le risposte delle strutture sane e tumorali, con particolare attenzione alla crescita e alla morfologia. Le osservazioni hanno evidenziato che la presenza di fibroblasti nella matrice induce modifiche significative nella morfologia, nell’organizzazione cellulare e nel potenziale, suggerendo un’interazione dinamica e attiva tra cellule e stroma. I dati raccolti mostrano come la modulazione delle proprietà meccaniche e cellulari della matrice influisca direttamente sulla crescita, sull’architettura e sul comportamento fenotipico delle cellule, in un’ottica comparativa tra condizioni sane e patologiche. Il modello sviluppato, pur mantenendo un livello di complessità inferiore rispetto al microambiente tumorale in vivo, rappresenta un sistema riproducibile e adattabile per l’analisi delle interazioni epitelio–stroma. Inoltre, esso costituisce una piattaforma promettente per applicazioni future nello screening farmacologico ad alta risoluzione, nella medicina personalizzata e nella ricerca preclinica in oncologia.