Sviluppo e validazione di una metodica di Real-Time qPCR per l’identificazione e la quantificazione di geni di resistenza alle tetracicline in campioni di origine aviare.

Tetracyclines represent a widely used class of antibiotics for the treatment of bacterial infections in both human and veterinary medicine. The emergence and dissemination of bacterial strains resistant to this antibiotic class within the poultry sector constitute a growing and serious threat not only to animal health but also to public health, due to the potential transfer of resistant bacteria along the food chain. The aim of this thesis was to develop and validate a Real-Time qPCR assay for the identification and quantification of specific tetracycline resistance genes (tetA and tetB) in poultry-derived samples. Method optimization included a preliminary screening phase in which different primer pairs retrieved from the scientific literature were tested by end-point PCR at various annealing temperatures (Ta) to identify the optimal primer/Ta combinations for each assay. Based on these preliminary results, Real-Time qPCR was subsequently optimized using SYBR Green chemistry, with melting curve analysis employed for amplicon verification. Standard curves were generated and key analytical parameters were determined, including amplification efficiency (79,96% for tetA and 84,88% for tetB), linearity (R² ≥ 0,980), limit of detection (LOD: 217,44 copies/μL for tetA and 0,40 copies/µL for tetB), limit of quantification (LOQ: 2174,4 copies/μL for tetA and 37,71 copies/μL for tetB), and intra- and inter-assay repeatability (%CV < 10%). Subsequently, diagnostic validation was carried out using previously characterized Escherichia coli strains, either positive for tetA and/or tetB or negative for both genes, in order to calculate the diagnostic sensitivity (Se) and specificity (Sp) of the assay. The method showed a diagnostic Se of 100% for both genes, with Sp values of 94% for tetA and 97,8% for tetB. The developed assays demonstrated good efficiency, high reproducibility and discriminatory power, proving to be reliable tools for the identification and quantification of tetA and tetB genes. Furthermore, the use of SYBR Green provides a cost-effective and flexible alternative to probe-based systems, enhancing the robustness and applicability of the method.

Le tetracicline rappresentano una classe di antibiotici ampiamente utilizzata per il trattamento di infezioni batteriche sia in ambito umano che veterinario. La comparsa e la diffusione di ceppi batterici resistenti a questa classe di antibiotici nel settore avicolo rappresentano una crescente e seria minaccia non solo per la salute animale, ma anche per la sanità pubblica, a causa del potenziale trasferimento di batteri resistenti lungo la catena alimentare. L'obiettivo di questo elaborato di tesi è stato quello di sviluppare e validare una metodica di Real-Time qPCR per l’identificazione e la quantificazione di specifici geni di resistenza alle tetracicline (tetA e tetB) in campioni di origine avicola. La messa a punto della metodica ha previsto una fase preliminare in cui una selezione di diverse coppie di primers presenti in letteratura scientifica è stata testata mediante PCR end-point a differenti temperature di annealing (Ta), al fine di individuare la combinazione ottimale di primers/Ta per ogni saggio. Sulla base dei risultati ottenuti nella fase preliminare, è stata eseguita la messa a punto in Real-Time qPCR utilizzando la chimica SYBR Green e sfruttando l’analisi della curva di melting per l’identificazione dei prodotti amplificati. Nell’ambito della messa a punto e validazione dei saggi, sono quindi state ottenute le curve standard e definiti i principali parametri analitici, tra cui l’efficienza di amplificazione (79,96% per tetA e 84,88% per tetB), la linearità (R² ≥ 0,980), il limite di rilevabilità (LOD: 217,44 copie/μL per tetA e 0,40 copie/μL per tetB), il limite di quantificazione (LOQ: 2174,4 copie/μL per tetA e 37,71 copie/μL per tetB) e la ripetibilità intra-assay ed inter-assay (%CV < 10%). In una fase successiva, è stata condotta la validazione diagnostica mediante l’analisi di ceppi di Escherichia coli precedentemente caratterizzati, ovvero positivi per tetA e/o tetB o negativi per tali geni, al fine di calcolare la sensibilità (Se) e la specificità (Se) diagnostica del test. La metodica ha evidenziato Se pari al 100% per entrambi i geni e Sp del 94% per tetA e dell’97,8% per tetB. Le metodiche sviluppate hanno mostrato buona efficienza, elevata ripetibilità e capacità discriminatorie, dimostrando di essere due saggi validi per l’identificazione e la quantificazione dei geni tetA e tetB. L’impiego del SYBR Green rappresenta inoltre un’alternativa vantaggiosa rispetto all’uso di sonde, in termini di costi ridotti, maggiore flessibilità e robustezza della metodica.